Генетика багатоклітинних еукаріотів » Народна Освіта


Народна Освіта » Генетика » Генетика багатоклітинних еукаріотів






Генетика багатоклітинних еукаріотів

Найхарактернішими особливостями організації спадкового апарату еукаріотів порівняно з прокаріотами є (див. також розділи 1 і 2):

•    Наявність клітинного ядра з кількома молекулами ДНК, які є компонентами складних білково-нуклеїнових комплексів - хромосом.

•    Присутність, поряд із головним ядерним спадковим апаратом, цитоплазматичних елементів спадковості - ДНК усередині мі-тохондрій і хлоропластів.

•    Великий розмір еукаріотичних геномів, причому значна частка припадає на послідовності ДНК, які повторюються багато разів.

•    Мозаїчний принцип будови еукаріотичних генів, причому один ген може давати кілька різних функціональних продуктів за рахунок альтернативного сплайсингу.

•    Велика кількість генів, причому всі клітини багатоклітинного організму (за винятком деяких) містять ідентичні набори генів, хоча більша їхня частка є неактивною у клітинах даного типу. Це викликає необхідність реалізації складної системи регуляції експресії генів у процесі диференціювання клітин під час онтогенезу. Одним із важливих елементів цієї системи є епігенетична спадковість - забезпечення спадкування дочірніми клітинами не просто набору генів, а й системи специфічного блокування певної їхньої частини.

•    Статевий процес, що лежить в основі розмноження переважної більшості багатоклітинних організмів: нащадок отримує два набори алельних генів від двох батьків різної статі. Механізми визначення статі є важливим розділом генетики еукаріотів.

Базуючись на матеріалі попередніх розділів, розглянемо ці особливості детальніше.

ЕУКАРІОТИЧНІ ГЕНОМИ

Загальні риси будови еукаріотичних геномів

Усі гени багатоклітинного організму можна розділити на дві групи: 1) гени, від яких залежать певні універсальні функції, і які є активними в усіх клітинах, - "гени домашнього господарства" (housekeeping genes); 2) гени, що специфічно активуються в клітинах певного типу, -"гени розкоші" (luxury genes). Досить загальною ознакою генів першої групи є розташування в їхніх регуляторних зонах так званих CpG-острівців - ділянок із підвищеним вмістом динуклеотидів CpG (мається на увазі послідовність нуклеотидів уздовж подвійної спіралі). Загалом вміст цих динуклетидів у еукаріотичних геномах приблизно у п'ять разів менший за очікуваний унаслідок метилювання цитозину в складі CpG-контакту: 5mC (5-метилцитозин) спонтанно перетворюється на тимін, що є одним із джерел виникнення мутацій. Метилування цитозину в регуляторних ділянках є одним із механізмів репресії генів (див. нижче). Відповідно, гени, які зберігають свою активність у більшості клітин, містять неметильовані динуклеотиди CpG, вміст яких зберігається на високому рівні.

Загальна кількість білкових генів у геномах вищих еукаріотів варіює приблизно від 20 до 30 тис. (див. табл. 1.1). Приблизний розподіл еукаріотичних білків за їхніми функціями показано на рис. 6.1.

Серед еукаріотичних генів 25-50 % є унікальними (представлені в геномі єдиною копією), решта належать до родин генів, що складаються з кількох копій, як правило, не ідентичних. Відповідні (гомологічні але не ідентичні) білки становлять родину білків. Кілька родин (протеїнкінази, транскрипційні фактори певного типу, імуноглобулі-ни) містять сотні білків, більшість родин складається з кількох (до 30) білків. Гени такої родини часто об'єднані в геномі в кластери - знаходяться поряд у певній хромосомі (кластери генів теплового шоку, гло-бінові гени). Слід зауважити, що такий кластер не є опероном - кожен ген піддається регуляції як окрема одиниця транскрипції. Наприклад, кластер генів в-субодиниці гемоглобіну містить гомологічні гени, які активуються на певних стадіях індивідуального розвитку (рис. 6.2). Проте всі гени кластеру мають також спільну регуляторну зону, яка відповідає за загальний потенційно активний стан кластеру в клітинах, які в принципі мають здійснювати синтез гемоглобіну.

в-Глобіновий кластер містить також неактивний псевдоген (див. розділ 1). Після дезактивації гена (порушення внаслідок мутації ініціації транскрипції, сплайсингу тощо) псевдоген перестає бути об'єктом відбору, і в ньому накопичується велика кількість мутацій. Зрозуміло, що в першу чергу псевдогени з'являються саме в кластерах - коли є кілька копій гена, і пошкодження одного з них не приводить до фатальних наслідків.

Кілька генних кластерів повторюються в геномі багато разів. Серед білкових генів це стосується генів гістонів (див. розділ 1) - гени п'яти молекул гістонів завжди згруповані в кластер (кожен ген - окрема одиниця транскрипції), який повторюється до 100 разів. Іншим прикладом кластерів, що повторюються, є гени рибосомної РНК (див. розділ 2), але в цьому випадку кластер є одиницею транскрипції.

Крім генів, що повторюються, еукаріотичний геном містить значну кількість інших послідовностей, що повторюються (до 50 % геному). Основні типи таких повторів, крім уже згаданих псевдогенів, такі:

1.    Тандемні повтори. До таких відносять багатократні повтори коротких послідовностей по 6-8 пар основ у теломерах і повтори так званої а-сателітної ДНК у центромерах (довжина повтору варіює від 7 пар основ у дрозофіли до 100-200 пар основ у ссавців, у людини -171 пара основ). По всьому геному розподілені також так звані прості повтори (SSR, simple sequence repeats). Зазвичай виділяють мікроса-теліти - 1-15 пар основ, що повторюються від 10 до кількох тисяч разів, і мінісателіти - 15-500 пар основ, що повторюються до 100 разів. Кількість міні- та мікросателітних локусів становить десятки й сотні тисяч. Розподіл локусів за кількістю повторів є специфічною індивідуальною ознакою - на кшталт відбитків пальців.

2.    Сегментні дуплікації - великі блоки довжиною 1-200 тис. пар основ, які характеризуються високим ступенем гомології. Імовірно, сегментні дуплікації є продуктом колишніх порушень хромосом. Частіше зустрічаються в перицентромерних і субтеломерних зонах.

3.    Інтерсперсні (мобільні) елементи, здатні до переміщення та розмноження в межах геному, становлять основну кількість ДНК, що повторюється. Частина таких послідовностей є результатом колишньої активності мобільних елементів (таких, що втратили здатність до переміщення). Основні типи еукаріотичних мобільних елементів:

ДНК-транспозони - переміщення здійснюється шляхом вирізання ділянки ДНК із наступним вбудовуванням її в інше місце -цілком аналогічно до відповідних елементів у прокаріотів. Транспозони містять один або два гени (у різних видів), що кодують транспозазу - фермент, який забезпечує транспозицію елемента, - його вирізання з донорного сайта та вбудовування в сайт-мішень. Гени транспозази можуть бути пошкодженими -тоді транспозиція даного елемента відбувається з використанням транспозази, закодованої іншим ДНК-транспозоном.

Кодуюча частина транспозона фланкована невеликими інвертованими повторами, які впізнає транспозаза, вирізаючи фрагмент ДНК. Сайт-мішень - невелика специфічна послідовність ДНК, котра теж упізнається транспозазою і теж розрізається, після чого транспозаза каталізує вбудовування транспозона до сайта-мішені (рис. 6.3). Процес транспозиції залишає дволанцюговий розріз у місці, де містився транспозон. У разі незалежної від реплікації транспозиції (нереплікативна транспозиція), цей розріз піддається репарації за механізмом негомо-логічного з'єднання кінців (див. розділ 1). Тобто транспозон просто "стрибає" в інше місце. Але досить часто транспозиція

відбувається під час реплікації (реплікативна транспозиція) -тоді розріз репарується за механізмом гомологічної рекомбінації (див рис. 1.26): сестринська молекула ДНК використовується як матриця, і ділянка, що містила транспозон, відновлюється - транспозон і стрибає в інше місце, і залишається в донор-ному сайті, тобто "розмножується".

LTR-ретропозони - елементи послідовності, що містять довгі кінцеві повтори - Long Terminal Repeats - і кілька генів, зокрема ген зворотної транскриптази та інтегрази (аналог транспозази). Як і для наступних двох типів мобільних елементів, переміщення відбувається через проміжну молекулу РНК. Процес переміщення копії LTR-ретропозона нагадує життєвий цикл ретрові-русів (див. рис. 5.9). Першим етапом є транскрипція ретропо-зона, після чого синтезована мРНК транспортується до цитоплазми, де піддається трансляції. Зворотна транскриптаза, яка є продуктом цієї трансляції, здійснює синтез ДНК: мРНК використовується як матриця, 3'-кінець молекули тРНК - як праймер. Комплекс синтезованої ДНК-копії ретропозона з інтегра-зою повертається до ядра, де ця ДНК вбудовується в геном.

•    Інтерсперсні елементи LINE (Long INterspersed Elements) містять кілька генів, включаючи ген зворотної транскриптази. Після транскрипції та наступної трансляції мРНК у цитоплазмі синтезовані білки зв'язуються з мРНК, цей комплекс поверта-

ється до ядра, де й відбувається зворотна транскрипція та вбудовування елемента в геном. Синтез мРНК при транскрипції елемента LINE, як і для більшості інших еукаріотичних мРНК, закінчується на polyA-сигналі (див. розділ 2). Цей сигнал слабкий, що дозволяє елементу вбудовуватись в інтрони звичайних генів без особливих перешкод для експресії цих генів: система процесингу часто не помічає слабкий polyA-сигнал. Елементи LINE є, відповідно, надзвичайно поширеними мобільними елементами в геномі вищих еукаріотів.

Іноді вони є не просто ділянками "егоїстичної ДНК", що автономно розмножуються в геномі, а виконують певні конкретні біологічні функції. Наприклад, у дрозофіли відсутня теломераз-на система, і елементи LINE певного типу виконують функцію подовження кінців хромосом після реплікації: зворотна транс-криптаза виступає як теломераза, мРНК мобільного елемента -як теломеразна матрична РНК (див. розділ 1). Цікаво, що послідовності ДНК гена теломерази та елементів LINE характеризуються високою гомологією: цілком можливо, що теломеразна система походить від мобільних елементів LINE.

Інтерсперсні елементи SINE (Short INterspersed Elements) - короткі (100-400 пар основ) беззмістовні елементи, які використовують для переміщення ферменти системи LINE. До цього класу належить, зокрема, так званий Alu-повтор (назва походить від назви відповідної рестриктази, яка здатна специфічно гідролізувати цей елемент послідовності).

Мобільні елементи розподілені в геномі нерівномірно: є довгі ділянки, які на 90 % представлені мобільними елементами, і такі зони, де інтерсперсні елементи відсутні. Загалом спостерігається негативна кореляція між густиною генів і мобільних елементів. Винятком із цієї закономірності є позитивна кореляція між густиною генів та елементів типу SINE.

Генетичні ефекти активності мобільних елементів

Очевидним наслідком активності (переміщення) мобільних елементів є мутації, що спостерігаються за умови вбудовування (інсерції) мобільного елемента в кодуючу або регуляторну частину гена. Найкраще вивченими в цьому відношенні модельними об'єктами є кукурудза (саме на цьому об'єкті мобільні елементи були вперше відкриті Барбарою Мак-Клінток, див. історичну довідку наприкінці підручника) і дрозофіла.

У кукурудзи описано кілька родин мобільних елементів (Ac-Ds, Spm, Dt), які належать до класу ДНК-транспозонів. Кожна родина складається з елементів двох типів: автономних і неавтономних. Автономний елемент (одного типу на родину) здатен до переміщення за рахунок активності транспозази (див. рис. 6.3), що кодується самим автономним елементом. Неавтономні елементи, кількість і розмаїття яких є значно більшими, теж можуть переміщуватись, але тільки за умови, що вони будуть активовані автономними елементами тієї самої родини. Така активація відбувається, якщо об'єднати обидва типи елементів у геномі шляхом відповідних схрещувань. Насправді неавтономні елементи походять від автономних - це транспозони, в яких унаслідок мутацій утрачені (пошкоджені) активні гени транспозази, їхнє переміщення здійснюється за рахунок транспозази автономного елемента.

Наприклад, у родині елементів Ac-Ds роль автономного відіграє елемент Ac, а численні елементи Ds - роль неавтономних, що активуються за умови присутності в будь-якому місці геному елемента Ac (рис. 6.4). Активовані елементи Ds часто переміщуються (нерепліка-тивним шляхом), вбудовуючись у гени, котрі мають зовнішній прояв: на рис. 6.4 показано ситуацію, коли транспозон порушує ген, який відповідає за пурпурне забарвлення зерна. У результаті виникає мозаїчність забарвлення: при наступних поділах клітини, в якій відбулась така подія, утворюється незабарвлений клон.

Рис. 6.4. Активація елемента Ds і його переміщення до гена С, який визначає пурпурне забарвлення зерна кукурудзи. Клітинні клони, що походять від клітин, в яких відбулась така подія, втрачають забарвлення

У дрозофіли приблизно 80 % усіх спонтанних мутацій виникає внаслідок інсерції мобільних елементів. У тому числі, саме інсерція мобільного елемента copia (належить до класу LTR-ретропозонів) у ло-кус w+ Х-хромосоми приводить до мутації white, що згадувалася в розділі 3, - першої описаної мутації дрозофіли.

З активністю групи мобільних елементів дрозофіли класу ДНК-транс-позонів - Р-елементів - тісно пов'язане явище так званого гібридного дисгенезу - комплексу дегенеративних аномалій, що приводять до сте-

рильності (мутації, хромосомні аберації, порушення мейозу). Р-елемен-ти (до 30-50 копій) містяться в геномі лабораторних ліній, які так і позначаються як лінії Р-типу, у ліній М-типу Р-елементи відсутні.

Кодуюча частина Р-елемента містить ген транспозази - 4 екзони, що піддаються сплайсингу за двома альтернативними шляхами (рис. 6.5): у статевих клітинах зріла мРНК кодує активну транспозазу; у соматичних клітинах залишається один із інтронів, що приводить до синтезу скороченого білка, який є репресором транспозицій (блокує транскрипцію на Р-елементі). Таким чином, транспозиції Р-елемента є можливими тільки у статевих клітинах.

Звичайно, транспозиції можуть відбуватися тільки у статевих клітинах мух Р-типу. Але наявність у цитоплазмі яйцеклітини та заплідненого яйця значної кількості репресора транспозицій (материнський фактор) приводить до того, що транспозиції не відбуваються: у схрещуваннях Р-самки з будь-яким самцем народжується нормальне потомство без ознак гібридного дисгенезу. Він спостерігається тільки в нащадків від схрещування Р-самця (у якого присутні Р-елементи) і М-самки (у якої відсутні Р-елементи і, відповідно, репресор транспозицій у цитоплазмі яйця).

Цікаво, що лінії D. melanogaster, які було введено в лабораторну культуру понад 50 років тому, належать до М-типу. Мухи, знайдені в природі протягом останніх 30 років, майже завжди відносяться до Р-типу. Можливо, оскільки гібридний дисгенез запобігає схрещуванням мух різних типів, він є одним із механізмів видоутворення -сприяє ізоляції різних популяцій. Слід зауважити, що описана система є не єдиною системою дисгенезу, яка реалізується у дрозофіл.

Поряд із активністю мобільних елементів, сама наявність їх у геномі - наявність багатьох копій гомологічних ділянок ДНК - зумовлює хромосомні перебудови за механізмом гомологічної рекомбінації (див. розділ 1). Рекомбінація між мобільними елементами, які знаходяться в різних локусах двох гомологічних хромосом, є однією з причин нерівного кросинговеру, що розглядався в розділі 3, - реципрокної де-леції та дуплікації хромосомних ділянок (див. рис. 3.12).

Рис. 6.6. Внутрішньохромосомний кросинговер між гомологічними мобільними елементами, орієнтованими в один бік (ліворуч, делеція ділянки) і в різні боки (праворуч, інверсія ділянки)

Подібним чином гомологічна рекомбінація може відбуватися між мобільними елементами, що містяться в одній хромосомі. Якщо два елементи мають однакову орієнтацію своїх послідовностей, кросинговер між ними зумовлює делецію хромосомної ділянки - із хромосоми видаляється циркулярний елемент ДНК (рис. 6.6, ліворуч). Якщо орієнтація елементів є різною, відбувається інверсія ділянки хромосоми (рис. 6.6, праворуч). Як і при переміщенні мобільних елементів, результатом таких перебудов може бути втрата регуляторних ділянок, "підстановка" регуляторних елементів послідовності під інші гени, зміна напрямку транскрипції тощо.

-ш—і    •    •    •

Еволюційна зміна геномів

Порівняння відомих геномних послідовностей тварин приводить загалом до висновку, що ключову роль в еволюції відіграє не поява нових кодуючих послідовностей, а нові комбінації старих і поява нових регуляторних ділянок. При цьому у формуванні нових регуляторних послідовностей значну роль відіграють мобільні елементи.

Вміст мобільних елементів у геномах тварин варіює від 10 до 50 % (наприклад, курка - 9,4, собака - З5,5, миша - 40,9, людина - 45,5, опосум - 52,2 %).

Геноми ссавців дуже незначним чином відрізняються один від одного. Скажімо, для людини та миші спостерігається близько 80 % загальної гомології, при цьому ступінь гомології між екзонами є значно вищою. Навіть різниця в послідовностях білкових генів між людиною та сумчастим опосумом (Monodelphis domestica) дуже незначна - переважна більшість генів одного виду має аналогів у іншого. Головна різниця між людиною та опосумом щодо білкових генів - дуплікація частки з них, у результаті 15-20 % генів присутні в геномах двох видів у різній кількості. При цьому різні копії певного гена одного виду розрізняються між собою за кількістю нуклеотидних замін більше, ніж гомологічні гени опосума та людини, які присутні в геномах однократно. Це вказує на можливість виникнення нових генів шляхом дуплікації: нова копія гена або набуває нової функції (частіше як варіації старої), або стає зайвою. У першому випадку ген починає змінюватись під дією відбору, у другому - швидко деградує, накопичує нейтральні мутації та стає псевдогеном.

Але загалом за 180 млн років в екзонах сумчастих і плацентарних виникло дуже мало варіацій. Напевно, еволюція вищих еукаріотів головним чином відбувається за рахунок змін у регуляторних ділянках геному, а також рекомбінації екзонів і переміщення генів у активні / неактивні зони хромосом унаслідок хромосомних аберацій (див. нижче обговорення ефекту положення гена).

Один із підходів до ідентифікації регуляторних елементів - виявлення шляхом порівняльного аналізу гомологічних для різних геномів, консервативних ділянок серед некодуючих послідовностей - CNE (conserved non-coding elements). Такий порівняльний аналіз опосума, курки та плацентарних дозволив виявити CNE трьох типів: спільні для птахів і ссавців; спільні для всіх плацентарних, але також частково присутні у птахів і опосума; унікальні для плацентарних. Загальний розмір другої групи в геномі людини - 74 млн пар основ (окремі елементи мають розмір від десятків до сотень пар), з яких 20 % є унікальними для плацентарних (серед кодучих ділянок частка таких унікальних послідовностей становить 1 %). Отже, основна частина еволюційних змін плацентарних пов'язана з появою нових регуляторних ділянок. Серед цих ділянок виявилися, зокрема, енхансери та гени мікро-РНК. Велику кількість CNE знайдено в оточенні ключових регуляторних генів, які визначають шляхи індивідуального розвитку й диференціації клітин, - при тому, що самі ці гени відрізняються підвищеним консерватизмом. Отже, основні відмінності в будові плацентарних зумовлені додаванням нових регуляторних елементів до генів, що регулюють онтогенез.

Найцікавіше, що серед унікальних для плацентарних CNE принаймні 16 % є ділянками, які походять від мобільних елементів усіх чотирьох груп. Вважається, що ця оцінка є заниженою: значна кількість колишніх мобільних елементів просто значно змінилась за послідовністю після того, як ці елементи стали нерухомими й набули регуляторних функцій.

Висновок про виникнення еволюційних змін шляхом корекції регуляторних систем підтверджується нещодавнім аналізом геному актинії Nematostella (найпримітивніший вид серед справжніх багатоклітинних - Eumetazoa). Геном містить 450 млн пар основ, 18 тис. генів (приблизно стільки ж, скільки в людини), частка мобільних елементів становить 25 %. Останній спільний предок актинії, хребетних і комах жив приблизно 700 млн років тому. Порівняльний аналіз вказує, що ссавці успадкували близько 2/3 своїх генів від цього предка, актинії -майже стільки ж, комахи - 50 %. Загалом геном людини більше схожий (і за набором генів, і за порядком розташування їх на хромосомах) на геном актинії, ніж на геном дрозофіли.

Близько 80 % генів цього спільного предка Eumetazoa мають аналоги поза межами тваринного царства - серед одноклітинних. Серед решти 20 % генів приблизно чверть містять блоки (екзони або групи екзонів), що зустрічаються в одноклітинних, але в інших комбінаціях. Отже, один із основних шляхів виникнення нових генів - це перекомбінування існуючих екзонів у новому порядку. Звичайно, ці нові гени багатоклітинних відповідають за нові функції: регуляцію онтогенезу, міжклітинні взаємодії, передачу міжклітинних сигналів, регуляцію клітинного циклу тощо.

Таким чином, уже перші представники тварин мали практично повний набір генів, який дозволив шляхом їхньої перекомбінації та тонкої підгонки регуляторних систем створити все розмаїття складних багатоклітинних організмів.

Запрограмовані геномні перебудови: У(0)}-рекомбінація імуноглобулінових генів

Геномні перебудови не завжди є спонтанними. Як згадувалось у розділі 5, існують запрограмовані перебудови генетичного матеріалу. Важливим прикладом таких запрограмованих (але багато в чому хаотичних) змін у певній зоні геному є дозрівання генів імуноглобулінів.

Основою імунної відповіді організму на появу чужорідної молекули чи частинки - антигену - є синтез імуноглобуліну певного типу, який має до цього антигену високу специфічну спорідненість. Кількість типів імуноглобулінів, так само як і антигенів, практично необмежена. Зрозуміло, що закодувати таке розмаїття у вигляді окремих імуноглобулінових генів також неможливо. Еволюційним рішенням цієї проблеми став особливий рекомбінаційний процес дозрівання імуноглобулінових генів.

Молекула імуноглобуліну складається з двох важких і двох легких поліпептидних ланцюгів (рис. 6.7). Кожен із ланцюгів має константну С-кінцеву (спільну для всіх імуноглобулінів) і варіабельну N-кінцеву частини. Варіабельні частини кожної пари важкого й легкого ланцюгів формують два антигензв'язувальні сайти на поверхні молекули.

Незрілі імуноглобулінові гени мають вигляд кластерів окремих елементів нуклеотидної послідовності - блоків, з яких шляхом рекомбінації в імунокомпетентній клітині будується активний імуноглобу-ліновий ген. Кластер важкого ланцюга містить ~100 V-сегментів (від variable), що тандемно повторюються (послідовності всіх сегментів розрізняються між собою), ~30 D-сегментів (від diversity), 6 J-сегмен-тів (від joining) і С-ділянку, яка кодує константну частину ланцюга (рис. 6.8). Аналогічно побудований кластер легкого ланцюга, який містить тільки два типи варіабельних сегментів (~100 V- і 4 J-сегменти). Активний ген збирається із сегментів трьох (або двох) типів, як із кубиків, шляхом так званої V(D)J-рекомбінації: один випадковий D-сегмент з'єднується з випадковим J-сегментом (ділянка між ними вирізається), до них приєднується один із V-сегментів (рис. 6.4). Аналогічно, для легкого ланцюга об'єднуються один V- з одним із J-сегментів.

Перед кожним V-сегментом знаходиться промотор, у спейсері перед С-ділянкою - енхансер. Їхнє зближення після рекомбінації активує транскрипцію, зайві спейсери та інтрони константної частини видаляються з мРНК шляхом сплайсингу.

Отже, для важкого ланцюга може реалізуватися ~18 тис. комбінацій

між сегментами трьох типів, для легкого--400 комбінацій, загалом

за рахунок рекомбінації для обох ланцюгів утворюється ~7 млн варіантів послідовності. Додаткова варіабельність забезпечується за рахунок індукції мутацій у межах V-сегментів, а також завдяки застосування особливих механізмів при з'єднанні сегментів.

Рекомбінація залежить від сигнальних послідовностей, що фланкують з двох боків кожен із сегментів і є власне сайтами рекомбінації. Сигнальні послідовності розпізнаються певними білками (гомологами транспозази), які вирізають ділянку між двома сегментами. Після цього 3'-кінці обох сегментів добудовуються шляхом випадкового приєднання нуклеотидів - зрозуміло, що цей процес ще значно підвищує розмаїття послідовностей зрілих генів імуноглобулінів. Частина цих генів буде неактивною завдяки стоп-кодонам, які з певною імовірністю з'являються при такому випадковому синтезі, але це є прийнятною платою за загальне збільшення варіантів.

Нарешті кінці сегментів з'єднуються за допомогою системи репарації дволанцюгових розривів NHEJ (див. рис. 1.25): на останніх стадіях рекомбінації процес з'єднання сегментів імуноглобулінових генів навмисно "загрублюється" з метою підвищення варіабельності.

ЕПІГЕНЕТИЧНЕ СПАДКУВАННЯ

Великий розмір еукаріотичного геному (до половини якого припадає на послідовності, що повторюються) вимагає існування систем, які б визначали гарантовану інактивацію значної частини генетичного матеріалу. При цьому інактивований стан як некодуючої ДНК, так і значної частини генів у клітинах певного типу має відтворюватись у дочірніх клітинах після мітозу.

Успадкування такої тканиноспецифічної системи репресії (при збереженні повної генетичної програми даного організму) називають епігенетичною спадковістю. В її основі лежить передача клітинам-нащадкам не просто батьківської ДНК, а хроматину разом із певними хімічними маркерами (див. розділ 1) - маються на увазі патерни посттрансляцій-них модифікацій гістонів і метилювання ДНК. Такі маркери впізнають відповідні білки, які вступають у різноманітні взаємодії з репресорами й корепресорами транскрипції, ферментами, які здійснюють посттранс-ляційні модифікації, і білками, котрі додатково компактизують хрома-тинову фібрилу. У першу чергу, подібні системи працюють у ділянках гетерохроматину - частини хроматину, що зберігає високий ступінь компактності протягом інтерфази. Прикладами конститутивного гетерохроматину (такого, що утворюється в усіх клітинах) є теломерні та центромерні зони хромосом, одна з Х-хромосом самок ссавців. Інші ге-терохроматинові зони є специфічними для клітин певного типу.

НР1-залежна система репресії

Прикладом залучення білка НР1 (Heterochromatin Protein 1) до утворення гетерохроматину є центромери хромосом (рис. 6.9). НР1 містить два структурні домени, один з яких упізнає метильовані лізи-нові залишки гістонів, а інший має спорідненість до певних специфічних гістон-деацетилази (HD) і гістон-метилтрансферази (HMT), а також здатен взаємодіяти з іншою молекулою НР1.

Деацетилювання невпорядкованого хвоста гістона Н3 сприяє зв'язуванню специфічної НМТ, яка здійснює метилювання Lys9 гістона Н3. Цей метильований Lys (Me-Lys9) упізнається НР1, який, у свою чергу, рекрутує HD і НМТ, котрі підтримують деацетильований статус і здійснюють метилування суміжних нуклеосом: виникає лавиноподібний процес, що самопідтримується й поширюється на сусідні ділянки. Взаємодія між білками НР1 забезпечує додаткову компактизацію фібрили.

Природу межі, яка відділяє гетерохроматин у центромерній зоні, не з'ясовано, але гранична ділянка містить свій специфічний маркер -метильований Lys4 гістона НЗ (і деметильований Lys9).

У процесі реплікації, що здійснюється нерівномірно в різних ділянках (гетерохроматин реплікується в останню чергу), білки тимчасово знімаються з ДНК у реплікативній вилці (розділ 1). За точкою реплікації гістони батьківського хроматину (котрі несуть на собі гетеро-хроматинові маркери) повертаються на дочірні молекули ДНК разом із гістонами, синтезованими de novo. НР1 також повертається на той самий локус, де він був присутній, і відновлює патерни модифікацій нових гістонів та компактний (репресований) стан гетерохроматино-вої ділянки. Тобто гетерохроматиновий стан даного локусу відтворюється в дочірніх клітинах. При цьому НР1 має спорідненість до білків ламіни (розділ 1), що зумовлює розташування гетерохроматину в периферичних зонах клітинного ядра.

Подібна система репресії за участю НР1 широко використовується в інших ділянках гетерохроматину, а також для гарантованого блокування генів в еухроматинових зонах. Метилювання Lys9 гістона НЗ і деацетильований стан лізинів гістонів НЗ/ Н4 є найхарактернішою ознакою таких ділянок. Обидві модифікації, як описано вище, само-підримуються та підтримують одна одну через опосередковану дію НР1. При цьому важливу роль у забезпеченні репресованого стану відіграє метилювання цитозинів ДНК - інша ковалентна модифікація, яка також відновлюється при клітинному поділі й замикає своєрідне "коло репресії" (рис. 6.10).

Метилювання ДНК

Патерн тканиноспецифічного метилювання ДНК (утворення 5mC у складі динуклеотидів CpG, рис. 6.11) є результатом двох процесів: підтримання метильованого статусу після реплікації та метилювання de novo.

Підтримуюча ДНК-метилтрансфераза спрацьовує протягом 1-2 хв після реплікації: дві дочірні молекули ДНК містять батьківский ланцюг ДНК (із 5mС у складі CpG) і синтезований ланцюг, де цитозин не є метильованим. Метилтрансфераза впізнає такі напівметильовані динуклеотидні контакти й відновлює симетрію щодо метилювання С. За рахунок цього процесу патерн метилювання відтворюється в дочірніх клітинах, що є, поряд із відновленням модифікацій гістонів, одним із важливих механізмів епігенетичного спадкування.

Інші ДНК-метилтрансферази здійснюють метилювання ДНК de novo. Особливо важливим цей процес є на ранніх стадіях ембріонального розвитку, коли ДНК тотально деметильована. У процесі розвитку здійснюється метилювання, яке визначає специфічне вимикання певних груп генів при диференціюванні клітин. Крім того, деметилювання є можливим і в диференційованих клітинах, де метилтрансферази використовуються для відновлення метильованого статусу.

Залучення 5тС до репресії пов'язане з наявністю у складі певних білків особливих структурних модулів - MBD (Methyl Binding Domain), які мають специфічну спорідненість до метильованих динуклеотидів CpG. Білки, що містять MBD, є компонентами різноманітних репре-суючих комплексів. Зокрема, такі білки рекрутують до метильованих ділянок хроматину гістон-деацетилази та гістон-метилтрансферази. І навпаки: Me-Lys9 розпізнається білком, котрий містить хромодомен і рекрутує ДНК-метилтрансферазу (рис. 6.10).

Хоча Me-Lys9 і 5тС є загальними маркерами конститутивно репресованих ділянок хроматину, не завжди репресія та додаткова ком-пактизація залежить від НР1. Прикладом іншої системи є інактивація однієї з Х-хромосом у клітинах самок ссавців (див. підрозділ, присвячений генетиці статі). У складі Х-хромосоми, яка буде інактивованою (обирається випадково на ранніх стадіях розвитку), спрацьовує ген Xist, що продукує велику некодуючу молекулу РНК. Ці РНК укривають собою хромосому і взаємодіють з низкою білків, серед яких - гістон-метилтрансфераза (здійснює метилювання Lys9 гістона Н3). Метил-ювання Lys9 зумовлює метилювання ДНК, що приводить до епігенетичного спадкування. Крім того, до Х-хромосоми рекрутуються структурні компактизуючі білки (але не НР1).

Гетерохроматин і РНК-інтерференція

Гетерохроматин утворюється в першу чергу на послідовностях ДНК, що повторюються. Причому має значення не послідовність як така, а саме наявність повторів: штучне введення повторів до ге-номної ділянки викликає утворення гетерохроматинової зони. У формуванні й підтриманні гетерохроматинового стану повторів (принаймні в центромерах) важливу роль відіграє процес РНК-інтер-ференції (див. розділ 2).

При порушенні компактизації на центромерних повторах може відбуватися спонтанна транскрипція в різних напрямках. Оскільки матрицею є повтори, існує висока ймовірність синтезу комплементарних молекул РНК: утвориться дволанцюгова РНК, яка запустить процес інтерференції - нуклеаза Dicer розрізає дволанцюгову РНК на фрагменти (можуть бути далі ампліфіковані РНК-залежною РНК-полімеразою), які залучаються до комплексу RISC. У складі комплексу РНК взаємодіють із транскриптами, і відбувається деградація останніх. Крім деградації, інтерференція має інший наслідок: RISC, який опиняється в зоні повторів, рекрутує до хроматину гістон-метилтрансферазу, яка здійснює метилювання Lys9 гістона НЗ. За вже відомою схемою (рис. 6.9, 6.10) відбувається зв'язування НР1 і компактизація гетерохроматину.

Гетерохроматин формується також у зонах скупчення мобільних елементів. Активність мобільних елементів може контролюватися організмом - відповідну систему пригнічення транскрипції мобільних елементів, котрі використовують РНК як проміжну стадію, знайдено як у дрозофіли, так і в мишей. Система вмикається при сперматогенезі та складається з білків родини Piwi й коротких регуляторних РНК, комплементарних ділянкам мРНК, яка синтезується на мобільних елементах. Ці РНК і білки Piwi об'єднуються в комплекс. РНК спрямовує цей комплекс на мРНК мобільного елемента, білки комплексу здійснюють деградацію мРНК, що й запобігає переміщенню - загалом така система є аналогічною процесу РНК-інтерференції. Крім того, від присутності згаданих регуляторних РНК залежить також інтенсивне метилювання ДНК мобільних елементів, яке зумовлює конститутивну репресію їхньої транскрипції.

Ефект положення гена

Описаний досить давно ефект залежності прояву гена від його положення у хромосомі має безпосереднє відношення до епігенетичного спадкування гетерохроматинового стану.

Один із прикладів ефекту положення демонструє рис. 6.12: штучно індукована у статевих клітинах дрозофіли хромосомна перебудова з інверсією ділянки, яка на одному кінці містить ген w+ (червоні очі дикого типу), а на іншому - частину перицентромерної гетерохроматинової зони з межею, що не дозволяє гетерохроматину розповсюджуватися. Після такої інверсії на ранніх стадіях ембріонального розвитку гетерохроматин (який тепер не має межі) іноді поширюється на ген w+, що опинився поряд. Це приводить до вимкнення гена, і такий залежний від структури гетерохроматину репресований стан спадкується при мітозі. У результаті утворюються групи клітин білого кольору - мозаїчне око.

Якщо внаслідок хромосомних перебудов, нерівного кросинговеру або активності мобільних елементів поряд із гетерохроматиновою зоною опиняється група генів, то частота (імовірність) їхнього вимкнення залежить від порядку розташування - ген, що знаходиться ближче до гетерохроматинової ділянки, вимикається частіше.

ЦИТОПЛАЗМАТИЧНА СПАДКОВІСТЬ: ГЕНЕТИКА МІТОХОНДРІЙ І ХЛОРОПЛАСТІВ

Переважна більшість еукаріотичних генів міститься в клітинному ядрі. Крім ядра, свій власний генетичний матеріал мають цитоплазматичні органели еукаріотичної клітини: мітохондрії та хлоропласти. Геноми цих органел містять гени білків і РНК, необхідні для їхнього функціонування. За своєю організацією геноми органел значно відрізняються від ядерного геному й нагадують геноми прокаріотів. Молекулярна машинерія, яка забезпечує експресію генетичної інформації в органелах, також подібна до прокаріотичної. Ці факти лягли в основу ендосимбіотичної теорії походження мітохондрій і пластид, відповідно до якої органели виникли в результаті незалежних ендосимбіо-тичних подій: вільно існуючі а-протобактерії та ціанобактерії були захоплені протоеукаріотичною клітиною-хазяїном і еволюціонували у специфічні органели (мітохондрії та хлоропласти відповідно), які відповідають за дихання та фотосинтез. Під час коеволюції клітини-хазяїна й ендосимбіонта частина мітохондріальних і хлоропластних генів (інколи досить значна частина) була перенесена в ядерний ге-ном. Таким чином, наявність власного генетичного апарату забезпечує мітохондріям і хлоропластам своєрідну автономність від ядерного геному, але велика кількість компонентів, потрібних для виконання їхніх функцій, кодується ядерним геномом.

Геноми мітохондрій

Мітохондрії, які присутні практично в усіх еукаріотів за деякими винятками, відіграють центральну роль у синтезі АТР і деяких інших важливих фізіологічних процесах. Кількість мітохондрій на одну клітину може варіювати від декількох штук (наприклад, у сперміях) до декількох тисяч (у гепатоцитах). Кожна мітохондрія може нести декілька копій ДНК (мтДНК), які в комплексі з білками утворюють структуру, подібну до нуклеоїдів прокаріотів.

Генетичний код, що використовується власною системою трансляції мітохондрій, характеризується деякими відхиленнями від універсальної таблиці відповідності кодонів амінокислотам (див. рис. 2.1). Зокрема, універсальний стоп-кодон UGA в мітохондіях більшості видів кодує триптофан, у мітохондіях дріжджів кодон CUG відповідає треоніну замість лейцину, у мітохондріях ссавців AUA відповідає метіоніну замість ізолейцину тощо.

Популярною є думка, що більшість еукаріотів мають кільцеву молекулу мтДНК. Часто так воно і є, проте останнім часом накопичилися дані про те, що у великої кількості еукаріотів мтДНК є лінійною (малярійний плазмодій, гідра, деякі гриби та одноклітинні водорості). Іноді, наприклад у дріжджів, лінійна молекула мтДНК являє собою так званий конкатомер - складається з великих однакових ділянок послідовності, що тандемно повторюються. Лінійні мтДНК характеризуються наявністю специфічних кінцевих структур: ковалентно замкнені на кінцях комплементарні ланцюги, приєднані до кінців молекули специфічні термінальні білки або теломероподібні кінцеві повтори різноманітної довжини.

Зазвичай мітохондріальні геноми (мітохондріоми) представлені однією "хромосомою", однак є винятки. Так, мітохондрії гриба Spizellomyces punctatus містять три різні кільцеві молекули ДНК. У найпростішого Amoebidium parasiticum мітохондріом складається з декількох сотень лінійних молекул, які різняться за розмірами й послідовністю. Мітохондріальний геном рослин, як правило, складається з декількох молекул різного розміру. Одна з них, "основна хромосома", містить більшу частину генів, а кільцеві форми меншого розміру, які

перебувають в динамічній рівновазі як між собою, так і з основною хромосомою, утворюються внаслідок внутрішньо- та міжмолекулярної рекомбінації завдяки наявності гомологічних ділянок (рис. 6.13). Перебудови геномів мітохондрій у результаті рекомбінаційних подій, ведуть до делецій, дуплікацій, інверсій або інсерцій певних нуклеотид-них послідовностей або цілих генів. Такі зміни можуть викликати не тільки ушкодження наявних генів, але й появу нових працюючих генів. Вважають, що ця зміна структури мітохондріального геному контролюється ядром і є одним із механізмів регуляції ефективності експресії мітохондріальних генів.

Рис. 6.13. Схема утворення кільцевих молекул різного розміру в мітохондріях рослин. Рекомбінація відбувається по гомологічних ділянках, забарвлених однаковим кольором

Мітохондріальні геноми значно варіюють за розмірами: від 6 тис. пар основ у плазмодіїв до 2 млн 400 тис. пар основ у сітчастої дині. У тварин мтДНК має в основному невеликі розміри - у середньому 13-19 тис. пар основ. Відносно великі мітохондріоми (від 20 до 42 тис. пар основ) знайдені в молюсків, нематод і деяких комах. Мітохондріоми вищих рослини мають великі розміри (від 180 до 2 млн 500 тис. пар основ), містять значну кількість послідовностей, що повторюються, і відкритих рамок зчитування з невідомими функціями. Характерним для мітохондріомів рослин є наявність вбудованих ділянок хлоропластної ДНК.

Набір генів у мітохондріальних геномах варіює від 5 у плазмодіїв до 100 у джгутикового Reclinomonas americana. Для більшості еукаріотів середня кількість генів, які кодує мітохондріом, становить 40-50, з яких 12-20 є білковими. Геноми мітохондрій усіх еукаріотів кодують рРНК великої та малої субодиниць мітохондріальної рибосоми, а також частковий (інколи повний) набір власних тРНК. Білки, що кодуються мітохондріомами, в основному залучені до процесів перенесення електрона та синтезу АТР: субодиниця АТР-синтази (ген atp), компоненти комплексів дихального ланцюга (гени nad, sdh, cob, cox). У мтДНК рослин і деяких одноклітинних містяться гени рибосомних білків. Дещо атиповим за складом генів є мітохондріом дріжджів - він містить, зокрема, гени ендонуклеаз і зворотної транскриптази.

Різниця в розмірах мітохондріомів викликана некодуючими послідовностями - кореляція між розміром мтДНК і кількістю генів практично відсутня. Особливо велика кількість некодуючих послідовностей мтДНК (50-70 %) є характерною для вищих рослин. Частина таких послідовностей входить до складу інтронів (в основному зустрічаються в мітохондріальних генах грибів і вищих рослин, у генах ссавців інтрони відсутні), які видаляються з транскриптів під час сплайсингу. Більша частина некодуючих ділянок представлена міжгенними регіонами.

Усі компоненти реплікативного, транскрипційного та частина трансляційного апаратів мітохондрій кодуються ядерним геномом. Отже, експресія мітохондріальних генів перебуває під повним контролем ядра.

Геном хлоропластів

Хлоропласти вищих рослин містять багато ідентичних кільцевих дволанцюгових молекул ДНК, розміри яких коливаються від 120 до 220 тис. пар основ. Характерною особливістю хлоропластної ДНК (хлДНК) вищих рослин є наявність інвертованого повтору (ІП), довжина якого в середньому становить 20-30 тис. пар основ (варіює в різних видів від 5 до 76 тис. пар основ). У результаті гени, локалізовані в ІП, є дуплікованими в геномі хлоропластів. Відмінності за розмірами хлДНК різних видів в основному визначаються довжиною ІП. Винятком є хлДНК деяких бобових і хвойних, які не містять ІП. Вважають, що ІП був у загального предка вищих рослин.

Як правило, ІП представлений двома сегментами (ІП-1 та ІП-2), що розділяють хлДНК на велику й малу унікальні ділянки (рис. 6.14). Велика унікальна ділянка є найбільш варіабельною (для різних видів) частиною молекули. У деяких видів у процесі еволюції один сегмент ІП був повністю або частково втрачений.

Вражає подібність організації хлоропластного й бактеріального геномів. Основні регуляторні послідовності, такі як промотори і терміна-тори, в обох геномах фактично ідентичні. Білки, що кодуються хлоро-пластними генами, дуже схожі на бактеріальні, а деякі групи генів із близькими функціями (скажімо, гени рибосомних білків) організовані однаково в геномах хлоропластів, Е. coli та ціанобактерій. Разом із тим, на відміну від прокаріотів, у генах хлДНК присутні інтрони.

Велика кількість генів локалізована в кластерах, що експресуються у вигляді великих поліцистронних первинних транскриптів. Останні процесуються до оліго- і моноцистронних мРНК, що піддаються сплайсингу та редагуванню. Редагування транскриптів хлоропластних генів виявлено тільки у вищих рослин; найчастіше спостерігаються заміни С ^ U шляхом дезамінування. Аналогічний процес, що викликає заміни амінокислотних залишків у відповідних білках, відбувається і в мі-тохондріях деяких еукаріотів (найпростіших, грибів і рослин).

За складом і порядком розміщення генів хлоропластні геноми вищих рослин є високо консервативними. У вивчених геномах хлоропластів вищих рослин виявлено від 108 до 122 генів, 95 з яких є однаковими й зустрічаються в усіх видів. За функціональністю гени хлоропластів можна розділити на три групи: гени апаратів транскрипції та трансляції; гени, що пов'язані з фотосинтезом; гени фото-синтетичного метаболізму (біосинтезу амінокислот, жирних кислот, пігментів тощо). До генів першої групи відносять гени рРНК, тРНК (близько 30), деяких субодиниць хлоропластної РНК-полімерази, приблизно 20 генів рибосомних білків і кількох факторів трансляції. До другої групи - гени, що кодують деякі білки, які є компонентами фотосистем I і II, комплексу цитохромів b/f, АТР-синтази, субодиниць NADH-дегідрогеназного комплексу дихального ланцюга та велику субодиницю ключового ферменту фотосинтезу рибулозобісфо-сфаткарбоксилази. Гени третьої групи найменш вивчені. До неї відносять ген accD, що кодує в-субодиницю ацетил-СоА-карбокси-лази прокаріотичного типу, яка бере участь у біосинтезі жирних кислот. Геноми хлоропластів злаків не мають гена accD. У мохоподібних і голонасінних виявлено гени, пов'язані з біосинтезом хлорофілу. Їх було ідентифіковано за схожістю з відповідними генами фотосинтезуючих бактерій.

Усі відомі білки, які кодуються в хлоропластах, входять до складу великих ферментативних комплексів. Ці комплекси також містять одну або декілька субодиниць, що кодуються ядерним геномом. Цікаво, що субодиниці, котрі кодуються ядерним геномом, є регуляторними, а ті, що кодуються хлДНК, - каталітичними. Усі найважливіші білки, які беруть участь у реплікації, транскрипції та трансляції також кодуються ядерним геномом. Тобто, як і для мітохондрій, усі процеси, що відбуваються у хлоропластах, перебувають під жорстким контролем ядра.

Основні характеристики спадкування генів органел

У диплоїдних видів еукаріотів ядерні гени зумовлюють успадкування ознак за законами Менделя в результаті того, що, за винятком зчеплених зі статтю ознак, нащадки отримують по одній копії кожного гена від обох батьків. Мітохондрії та пластиди не розподіляються по гаметах і дочірніх клітинах аналогічно хромосомам ядра, тому закономірності спадкування генів органел і ознак, які вони зумовлюють, значно відхиляються від менделівських. Оскільки мітохондрії та пластиди знаходяться в цитоплазмі клітин, такий тип спадкування називається позаядерним (позахромосомним), або цитоплазматичним.

Особливості позаядерного спадкування зумовлені в першу чергу тим, що гамети різних статей мають непорівнянні кількості мітохондрій і пластид. Найчастіше жіночі гамети містять тисячі мітохондрій (і пластид у рослин), а чоловічі - одиниці. У результаті в зиготі переважають міто-хондрії та хлоропласти матері. У деяких видів, зокрема в людини, чоловічі мітохондрії взагалі не потрапляють до зиготи. Отже, спадкування генів органел відбувається в основному по материнській лінії (особливості позаядерної спадковості в людини див. у розділі 7). Проте це загальне правило не носить абсолютного характеру - для деяких видів гризунів спостерігається передача мітохондрій у зиготу від обох батьків.

Особливості спадкування хлоропластних генів були вперше вивчені при дослідженні спадкування строкатості листків нічної красуні. Якщо в ролі материнської форми брали квіти безхлорофільної рослини і запилювали їх пилком зеленої рослини, то у F1 спостерігали тільки безхлорофільні форми (незабаром гинуть). При реципрокному схрещуванні у F1 усі рослини нормальні. Якщо запилювали квіти строкатих рослин пилком зеленої форми, у F1 виявляли безхлорофільні, строкаті й зелені рослини. При реципрокному схрещуванні - тільки зелені. Таким чином, розглянутий приклад демонструє материнський тип спадкування хлоропластного геному в рослин, для якого є характерною контрастна різниця між результатами реципрокних схрещувань. Досить схожі відмінності в таких схрещуваннях спостерігаються при схрещуванні зелених і строкатих форм у інших рослин. Проте все залежить від кількостей цитоплазми, що привносяться в зиготу яйцеклітиною та сперматозоїдом. Так, якщо квіти строкатих рослин герані запилюють пилком зеленої, то до 30 % нащадків будуть строкатими, а 70 % - зеленими. При реципрокному схрещуванні 70 % нащадків є строкатими, а 30 % - зеленими. Тобто в рослин спостерігається також і двобатьківське спадкування генів хлоропластів.

ГЕНЕТИКА СТАТІ

Статевий шлях розмноження, притаманний вищим еукаріотам, передбачає наявність двох статей, представники яких передають нащадку по одному гаплоїдному набору своїх генів. Стать можна визначити як сукупність морфологічних, фізіологічних і поведінкових ознак, пов'язаних із розмноженням організмів, і за якими розрізняються жіночі та чоловічі особини. Розвиток цих ознак в онтогенезі -детермінація статі - є складним процесом, до якого залучена велика кількість різних генів і додаткові модулюючи чинники, здатні впливати на напрямок розвитку чоловічої або жіночої статі.

Загальну схему визначення статі наведено на рис. 6.15. Початковим етапом є вплив на яйцеклітину, зиготу чи особину стать-детермінуючих факторів. Це можуть бути як фактори середовища (температура, кількість поживних речовин у яйцеклітині тощо), так і генетичні фактори (наявність у зиготі генів, котрі визначають стать). Дія стать-детермінуючого фактора зумовлює експресію відповідного ключового гена, який впливає на активність інших генів, що визначають розвиток жіночих чи чоловічих гонад (статевих залоз). Клітини гонад починають продукувати специфічні для даної статі гормони, які, у свою чергу, регулюють експресію генів, що відповідають за формування первинних статевих ознак - внутрішніх і зовнішніх статевих органів. У подальшому з'являються вторинні статеві ознаки (додаткові ознаки, за якими відрізняються статі після статевого дозрівання).

Механізми визначення статі

За природою стать-детермінуючого сигналу розрізняють середо-вищний і генетичний механізми визначення статі. Якщо стать зумовлюється середовищем, то розрізняють про- та епігамний типи визначення статі. У першому випадку вона установлюється до запліднення яйцеклітини, а в другому - після. Найчастіше стать визначається генотипом зиготи (генетичний механізм), тобто залежить від того, які стать-детермінуючі гени мали сперматозоїд і яйцеклітина. У такому разі кажуть про сингамний тип визначення статі - у момент запліднення яйцеклітини.

Прогамний і епігамний типи визначення статі. Прогамний тип притаманний, наприклад, коловерткам і попелицям. При статевому розмноженні цих видів стать нащадка визначається розміром яйцеклітини (кількістю поживних речовин у ній). Незалежно від того, які генотипи мають яйцеклітина та сперматозоїд, що утворюють зиготу, із запліднених яйцеклітин великого розміру розвиваються самки, а з дрібних - самці. У даному разі детермінуючим сигналом розвитку статі є внутрішнє середовище яйцеклітини.

Класичним прикладом епігамного типу визначення статі є детермінація статі у морського черв'яка Bonellia viridis. Самки можуть досягати розміру до одного метра, тоді як самці мають довжину не більше 3 мм і паразитують у статевих шляхах самки. Визначення статі відбувається під час розвитку личинки: личинка, що вільно плаває, може випадково прикріпитися або до самки, або до будь-якого субстрату. У першому випадку під дією гормонів, які виділяє самка, із личинки розвивається самець-паразит, у другому - самка.

Епігамним типом визначення статі також характеризуються деякі види черепах, крокодилів і ящірок. Стать-детермінуючим сигналом для цих видів є температура інкубації заплідненого яйця, оскільки вона впливає на експресію ключового гена Tdf (testis determining factor), який визначає розвиток чоловічих гонад - при підвищенні температури оточуючого середовища у крокодилів і ящірок з яєць вилуплюється більше самців, у черепах - самок.

Сингамний тип визначення статі. У тваринному та рослинному світі найпоширенішим є залежне від генетичних факторів визначення статі в момент утворення зиготи. Проте слід зазначити, що іноді спостерігаються перехідні варіанти, які поєднують генетичний і середо-вищний механізми. Так, у риб стать визначається за сингамним типом (залежить від присутності статевих хромосом, див. нижче), проте, у деяких видів під час індивідуального розвитку може спостерігатися зміна статі в дорослих особин під впливом навколишнього середовища, тобто сингамний тип визначення статі змінюється на епігамний. Наприклад, в акваріумних рибок Oryzias latipes, стать яких детермінується статевими хромосомами, відбувається зміна статі з чоловічої на жіночу при інкубації заплідненої яйцеклітини в середовищі, збагаченому жіночими статевими гормонами. Найцікавішим є приклад зміни статі в риб у зв'язку із "соціальними умовами". Так, у популяції риби-клоуна Botia macracanthus найбільша риба в групі стає самкою, друга за розміром - самцем. Усі інші особини залишаються статево незрілими. Якщо самка гине, самець перетворюється на самку, а наступна за розміром риба у групі стає самцем. Механізм такої "соціальної" зміни статі, який зустрічається в багатьох інших видів риб, залишається нез'ясованим.

Конкретні механізми, які зумовлюють детермінацію статі за суто сингамним типом, досить різноманітні. Існують два основні класи таких механізмів: алельний і хромосомний.

За алельним механізмом стать визначається одним геном, представленим декількома алелями. Скажімо, у шаленого огірка Ecballium elaterium стать визначається геном, який має три алелі: а° зумовлює розвиток чоловічої статі, аа - жіночої, а+ визначає гермафродитизм (розвиток чоловічих і жіночих ознак в одної особини). Алель аD домінантний щодо двох інших алелів, алель а+ - щодо рецесивного аа. Таким чином, рослини з генотипами аDа+ та аDаd є чоловічими, із генотипом аааа - жіночими, із генотипами а+а+, а+аd - гермафродитами.

Цікавий механізм визначення статі реалізується в перетинчастокрилих (ос, мурах, бджіл). Самки розвиваються із запліднених (диплоїд-них) яєць, а самці (трутні) - із незапліднених (гаплоїдних). Під час подальшого розвитку самців відбувається подвоєння хромосом в соматичних тканинах (автодиплоїдизація). Довгий час вважалося, що саме факт диплоїдності або гаплоїдності зиготи є вирішальним у визначенні статі, тому такий механізм отримав назву гаплодиплоїдного. Виявилося, однак, що визначення статі в перетинчастокрилих залежить від одного гена, який має велику (понад 20) кількість алелів. Отже, гаплодип-лоїдний тип визначення статі можна вважати різновидом алельного. Гетерозиготні за цим геном особини є самками. Зрозуміло, що трутні не можуть бути гетерозиготами: вони розвиваються з яєць, які несуть тільки по одній копії всіх генів, а при відновленні диплоїдної кількості хромосом соматичні клітини будуть гомозигиготними за всіма генами. У випадку тривалих споріднених схрещувань (інбридингу) відбувається зменшення гетерозиготності популяції (див. розділ 8), і у вуликах можуть з'являтися самці, що розвинулись із запліднених яєць.

У багатьох видів гени первинного визначення статі містяться у специфічних статевих хромосомах, які й зумовлюють детермінацію статі. Такий механізм називається хромосомним визначенням статі.

Існує декілька різновидів визначення статі хромосомного типу:

Тип ХХ/Х0 (характерний для деяких комах, наприклад, коників і клопів роду Protentor) - самки мають дві статеві хромосоми одного типу, які позначаються як Х-хромосоми (ХХ), а самці лише одну (Х0).

• Тип ХХ/ХУ (ссавці, риби, деякі комахи, деякі рослини) - жіноча стать має дві однакові статеві хромосоми (ХХ), а чоловіча - дві різні (ХУ).

• Тип ZZ/ZW (птахи, плазуни, метелики). На відміну від попереднього типу, особини, які мають дві однакові статеві хромосоми (ZZ), є самцями, а особини з двома різними хромосомами (ZW) - самками.

• Тип ZZ/Z0 (характерний для деяких метеликів) - самці є носіями двох однакових статевих хромосом (ZZ), а самки -лише однієї (Z0).

Стать, представники якої мають дві ідентичні статеві хромосоми та, відповідно, продукують ідентичні за цими хромосомами гамети, називається гомогаметною (гомогаметною статтю у ссавців є самки, а у птахів - самці). Стать, представники якої продукують різні за статевими хромосомами гамети, є гетерогаметною.

Молекулярні механізми визначення статі, навіть у межах одного хромосомного типу, можуть кардинально відрізнятися. Розглянемо два різні механізми визначення статі за типом ХХ/ХУ - у дрозофіли та ссавців.

У дрозофіли наявні два типи статевих хромосом - Х і У. Особини ХХ розвиваються як самки, а особини ХУ - як самці. При цьому із зиготи, що має тільки одну Х-хромосому (Х0) також розвиваються самці, а набір статевих хромосом ХХУ приводить до розвитку самки. Отже, генетично інертна У-хромосома у дрозофіли взагалі не відіграє ролі у визначенні статі: ключовим моментом є співвідношення (баланс) між кількістю Х-хромосом і кількістю наборів аутосом (табл. 6.1) - це положення було свого часу сформульване Бріджесом (Calvin Bridges) як балансова теорія визначення статі.

Таблиця 6.1. Співвідношення між числом Х-хромосом і кількістю наборів аутосом при визначенні статі у дрозофіли

За наявності в диплоїдній зиготі двох Х-хромосом, співвідношення між ними та кількістю наборів аутосом дорівнює 1 - саме за такої умови із зиготи буде розвиватися самка. Набір статевих хромосом ХУ приводить до відношення Х : А (див. табл. 1), що дорівнює 0,5, і з зиготи розвивається самець. Набір Х0 зумовить таке саме співвідношення між Х-хромосомами й аутосомами, тому особини Х0 є самцями. Набір статевих хромосом ХХУ визначить співвідношення, яке дорівнює 1, що забезпечить розвиток самки. За умови, що Х : А більше за одиницю, із зиготи розвивається надсамка, яка характеризується гіпертрофованими зовнішніми статевими ознаками самки; наслідком відношення, яке менше 0,5, є розвиток надсамця. Якщо відношення Х-хромосом до кількості наборів аутосом є проміжним між 1 і 0,5, із зиготи розвивається так званий інтерсекс, який характеризується проміжним між самцями та самками фенотипом.

Балансовою теорією пояснюється поява серед дрозофіл гінандро-морфів - особин, які мають частину клітин, тканин чи органів з ознаками, характерними для різних статей. Під час ембріонального розвитку при перших поділах зиготи з набором статевих хромосом ХХ, одна з Х-хромосом може бути втраченою (за механізмом виникнення анеуп-лоїдів, див. розділ 4), і відповідні клітини будуть родоначальниками тканин і органів, що розвиваються шляхом, характерним для самця.

Молекулярний механізм балансового визначення статі у дрозофіли пов'язаний із наявністю в Х-хромосомі двох генів - sis-a та sis-b, що виконують роль головного стать-детермінуючого сигналу. Білкові продукти цих генів утворюють комплекс із продуктом аутосомного гена da. Кількість продуктів гена da відповідає кількості аутосом (у диплоїдного організму - дві дози), а кількість продуктів генів sis-a та sis-b варіює залежно від кількості Х-хромосом у зиготі (одна або дві дози). Таким чином, у самок утворюється вдвічі більше цих білкових комплексів, ніж у самців. Білкові комплекси sis-da виконують роль факторів транскрипції, під контролем яких знаходиться ключовий ген розвитку статі - Sxl (Sex-lethal), що міститься в одній із аутосом. Подвійна концентрація фактора транскрипції є достатньою для активації гена Sxl у самки; у самця (одна Х-хромосома) ген не транскрибується на найбільш ранніх стадіях ембріонального розвитку, оскільки концентрація активатора транскрипції є недостатньою.

Ген Sxl містить вісім екзонів (див. рис. 6.16) і має два промотори -ранній і пізній. Фактор транскрипції sis-da активує ранній промотор, при транскрипції з якого (що відбувається тільки в самки) сплайсинг мРНК спрямований таким чином, що екзони 2 і 3 вирізаються з пре-мРНК (не показано на рис. 6.16). Продуктом гена є білок Sxl, він виконує роль регулятора сплайсингу власного гена при його транскрипції

з іншого - пізнього - промотора, що активується як у самця, так і в самки на трохи пізніших стадіях розвитку ембріона. Транскрипція з пізнього промотора зумовлює трохи інший шлях сплайсингу, коли в мРНК залишається скорочений екзон 1 разом з екзоном 2. Регулятор сплайсингу Sxl забезпечує вирізання екзона 3 у самки, у самця (за відсутності Sxl) цей екзон залишається (рис. 6.16). Оскільки екзон 3 містить стоп-кодон, трансляція мРНК у самця приводить до синтезу нефункці-онального поліпептиду. У самки синтезується трохи змінена форма білка Sxl, яка підтримує сплайсинг власної мРНК шляхом, характерним для самки, а також виконує роль регулятора сплайсингу мРНК гена tra (transformer): у самки утворюється функціональна мРНК, у самця - нефункциональна, яка містить стоп-кодон у екзоні 2 (рис. 6.16).

Рис. 6.16. Альтернативний сплайсинг у процесі детермінації статі у дрозофіли. Для гена Sxl показано сплайсинг у самки й самця при транскрипції гена з пізнього промотора

Функціональний білковий продукт гена tra, у свою чергу, спрямовує сплайсинг мРНК гена dsx (double-sex) за типом самки: у мРНК наявні перші чотири з шести екзонів - за екзоном 4 розташований polyA-сигнал (див. розділ 2), який у присутності білка Tra впізнається системою процесингу. У результаті утворюється білок dsxF, який зумовлює розвиток самки, запускаючи активацію відповідного каскаду генів. За відсутності білка Tra в самця вказаний polyA-сигнал не розпізнається, і синтезується мРНК, що містить усі шість екзонів (рис. 6.16), - відповідний білок dsxM зумовлює активацію генів, які відповідають за розвиток ознак самця.

У ссавців, як і в дрозофіли, особини з набором статевих хромосом XX мають жіночу стать, а з набором XY - чоловічу. Але, на відміну від дрозофіли, особини Х0 (при втраті Y-хромосоми) мають жіночу стать (з певними вадами, див. розділ 7), а особини з додатковими Х-хромо-сомами (XXY, XXXY, XXXY) - чоловічу. Отже, у визначенні статі у ссавців ключову роль відіграє Y-хромосома: за її наявності розвивається особина чоловічої статі, за відсутності - жіночої. Визначальна функція Y-хромосоми зумовлена наявністю в її складі ключового гена TDF/SRY (Testis Determining Factor/ Sex determining Region Y), продукт якого є транскрипційним фактором для генів, котрі визначають розвиток тестикул (чоловічих гонад) у зародку.

Спадкування ознак і стать

Спадкування ознак, на які впливає стать, має певні особливості (див. також основні принципи спадкування ознак, розглянуті в розділі З). Зазвичай виділяють три групи таких ознак: ознаки, зчеплені зі статтю; ознаки, обмежені статтю; ознаки, залежні від статі.

Ознаки, зчеплені зі статтю, - це ознаки, гени яких розташовані в статевих хромосомах X (Z) або Y (W) (ідеться про гени, які зовсім не обов'язково мають відношення до статевих ознак). Статеві хромосоми X (Z) і Y (W) суттєво відрізняються одна від одної набором генів. Особина гомогаметної статі може бути як гомо-, так і гетерозиготою за певним геном. Гетерогаметна стать є гемізиготою за більшістю генів: у генотипі існує лише одна копія гена - або в хромосомі X (Z), або Y (W). Отже, у гомогаметної статі рецесивна ознака виявляється лише тоді, коли ген перебуває в гомозиготному стані, а в гетерогаметної статі - завжди.

Прикладом X-зчеплених ознак у людини є гемофілія та дальтонізм, а Y-зчеплених - гіпертрихоз (оволосіння вушної раковини) і перетинка між пальцями. Ознаки, зчеплені з X-хромосомю, спадкуються за принципом крис-крос (див. розділ З). Ознаки, зчеплені з Y-хромосомою, -лише по чоловічій лінії й називаються голандричними.

Незважаючи на те, що X- та Y-хромосоми ссавців суттєво відрізняються за набором генів, у дистальних районах короткого та довгого плечей вони мають гомологічні ділянки - псевдоаутосомні регіони.

Гени, які знаходяться в цих ділянках (приблизно 10), формально зчеплені зі статтю (містяться в статевих хромосомах), але характер спадкування мають такий самий, як і аутосомні.

Ознаки, обмежені статтю, - це ознаки, гени яких знаходяться в аутосомах, але виявляються лише в одній зі статей. Прикладами таких ознак є яйценосність птахів і молочність ссавців. Особини чоловічої та жіночої статей мають гени цих ознак, але їх прояв є можливим лише в самок, оскільки самці позбавлені необхідних для цього органів.

Ознаки, залежні від статі. Гени цих ознак містяться в аутосомах і можуть виявлятися у представників обох статей, але тип спадкування (рецесивний або домінантний) залежить від статі. Наприклад, ознакою, яка залежить від статі в людини, є облисіння. Алель, котрий відповідає за часткове облисіння у чоловіків, є домінантним і, відповідно, ознака виявляється за наявності однієї його копії. У жінок фе-нотиповий прояв цієї ознаки потребує присутності в генотипі двох копій алеля, тобто той самий алель поводить себе як рецесивний. Експресія генів залежних від статі ознак визначається гормональним статусом, і в результаті гетерозиготи різних статей мають різні фено-типи. Аналогічно спадкуються ознаки рогатості та комолості в овець.

Слід зауважити, що більшість генів, які визначають характерний для даної статі фенотип, знаходяться не в статевих хромосомах, а в аутосомах. Ознаки, які вони зумовлюють (первинні та вторинні статеві ознаки), і є ознаками, обмеженими статтю або залежними від неї. Їхній прояв контролюється відповідним балансом чоловічих і жіночих статевих гормонів.

Компенсація дози генів і походження статевих хромосом

Оскільки в гомогаметної статі наявні дві однакові статеві хромосоми, кількість генів, які містяться в цих хромосомах, а отже, і їхніх білкових продуктів (доза генів), є вдвічі більшою, ніж у гетерогаметної статі. Збільшення чи нестача певних білків може негативно впливати на розвиток організму, тому в процесі еволюції виникли механізми, які на відповідних стадіях розвитку "вирівнюють" кількість продуктів генів статевих хромосом у осіб жіночої та чоловічої статей - механізми компенсації дози генів.

Існує два шляхи такої компенсації. У самців дрозофіли спостерігається гіперактивація єдиної Х-хромосоми за рахунок підтримання де-компактизованого стану хроматинової фібрили. У цьому процесі бе-руть участь продукти п'яти генів (білки MSL), які утворюють мульти-білковий комплекс, що зв'язується з Х-хромосомою: MSL-комплекси підтримують дифузність фібрили й рекрутують до хроматину комплекси ремоделювання та гістон-ацетилтрансферази (див. розділ 2), що забезпечує значне зростання ефективності ініціації транскрипції. Компенсація дози генів контролюється ключовим геном Sxl, про який уже йшлося: у самок функціональний білок Sxl не дозволяє MSL-білкам розташовуватися на Х-хромосомах і тим самим запобігає гіперактивації.

У ссавців спостерігається протилежний механізм компенсації дози генів за рахунок інактивації однієї з Х-хромосом у самок. Інактивація відбувається на ранніх етапах дроблення зиготи (16-32 бластомери), а вибір хромосоми, яка буде інактивована, є випадковим. Таким чином, і в самок, і в самців у соматичних клітинах працює тільки одна Х-хромо-сома. Самки, гетерозиготні за Х-зчепленими генами, є мозаїками (у деяких клітинах експресується домінантний алель, в інших - рецесивний).

Детальний механізм інактивації однієї з Х-хромосом самок ссавців до кінця не з'ясований. Відомо, що розпочинається інактивація зі специфічної ділянки Х-хромосоми, яка позначається як Xic (X inactivation center). Xic містить декілька генів, один із яких - ген Xist - експресується лише в Х-хромосомі, що буде інактивована. Продуктом цього гена є досить довга молекула РНК, яка не піддається трансляції. Молекули Xist-РНК зв'язуються з Х-хромосомою майже по всій довжині й рекрутують певні білки, які забезпечують гетерохроматинізацію. Інактивована Х-хромосома виявляється в інтерфазних ядрах у вигляді гетерохроматинового компактного утворення поблизу мембрани -тільця Барра (Murray Barr). У разі наявності кількох Х-хромосом (ХХУ, ХХХУ і т. д.) активною залишається лише одна з них - кількість тілець Барра дорівнює кількості Х-хромосом мінус одиниця.

Оскільки організми, які мають гетероморфні статеві хромосоми, належать до різних царств, статеві хромосоми, напевно, виникали в процесі еволюції неодноразово. На користь такого висновку свідчить і той факт, що навіть у межах однієї систематичної групи, наприклад рептилії, є види і з хромосомним типом визначення статі, і такі, що не мають статевих хромосом (стать визначається температурним режимом).

Зрозуміло, що статеві хромосоми відокремились як одна з аутосом-них пар, про що свідчить наявність у них псевдоаутосомних регіонів. Найімовірніше, спочатку виникли гомоморфні (однакові за морфологією) статеві хромосоми, а пізніше - гетероморфні. Так, у змій більш архаїчні види мають гомоморфні статеві хромосоми, єдиною різницею між якими є час реплікації: Z-хромосома реплікується на початку, а W-хромосома - наприкінці S-фази клітинного циклу. Молодші види змій мають уже гетероморфні статеві хромосоми. Очевидно, одна зі статевих хромосом змінюється шляхом хромосомних перебудов, принаймні для ссавців вважається, що Y-хромосома за походженням є Х-хромосомою, яка піддалася численним делеціям.

ГЕНЕТИКА ІНДИВІДУАЛЬНОГО РОЗВИТКУ

Розвиток будь-якого багатоклітинного організму розпочинається з утворення зиготи - клітини, яка виникає в процесі злиття статевих клітин (яйцеклітини та сперматозоїда). Після запліднення ядро сперматозоїда (пронуклеус) опиняється в цитоплазмі яйцеклітини, зливається з її ядром, відтворюючи таким чином характерний для даного виду диплоїдний набір хромосом. У більшості організмів одразу після запліднення зигота розпочинає серію мітотичних поділів (так зване дроблення зиготи), у результаті утворюється велика кількість дрібних клітин - бластомерів. Розвиваючись, кожен із цих бластомерів (або їхня група) утворює функціонально спеціалізовані клітини з притаманною лише їм морфологією та фізіологічними особливостями. Отже, запліднена яйцеклітина здатна дати початок різним типам клітин, тобто забезпечити розвиток від однієї клітини до багатоклітинного організму. Ця властивість зиготи називається тотипотентнютю. Вона притаманна також і бластомерам, які утворилися в перших чотирьох поділах зиготи. При подальших поділах тотипотентність клітин зменшується, кожна з них "обирає" свою програму розвитку - стає детермінованою. У такій клітині відбуваються стійки внутрішні зміни (як у структурі ядра, так і в структурі цитоплазми), що роблять 'її саму та її нащадків відмінними від інших клітин ембріона й визначають подальший шлях спеціалізації. Слід зазначити, що ці зміни не викликають суттєвої морфологічної різниці між клітинами різних типів. Детермінована клітина, продовжуючи свій розвиток, набуває видимих морфологічних відмін і властивих лише даному типу клітин функцій. Така остаточно спеціалізована клітина називається диференційованою.

Детермінація та диференціація клітин пов'язані з поступовою зміною активності генів у процесі розвитку організму: певні групи генів починають активно експресуватися в одних клітинах і переходять у репресований стан у інших. Така диференційна картина експресії генів виникає вже на ранніх етапах розвитку зиготи й викликана неоднорідністю цитоплазми яйцеклітини. Під неоднорідністю цитоплазми яйцеклітини розуміють нерівномірний розподіл у межах клітини цитоплазматичних детермінант - певних молекул мРНК та їхніх білкових продуктів. Оскільки ці мРНК і білки синтезуються й накопичуються в яйцеклітині ще в процесі оогенезу, то гени цих цитоплазматичних детермінант називають генами з материнським ефектом. Таким чином, ядра бластомерів, які утворюються в результаті дроблення зиготи, опиняються в різному цитоплазматичному оточенні, яке зумовлює вибіркову транскрипцію генів. Цитоплазматичні детермінанти, створюючи градієнт концентрацій уздовж різних осей яйцеклітини, визначають передньо-задню та дорсовентральну осі зародку. У ході дроблення зиготи бластомери, які знаходитимуться у відповідних частинах зародку, зумовлять розвиток притаманних для даної частини організму органів і тканин.

Генні продукти, які синтезуються в окремих групах бластомерів, спричиняють ще значніші відмінності в цитоплазматичному оточенні ядер клітин, що у свою чергу приводить до активації інших специфічних генів. Такий каскад активації чи інактивації генів підсилюється за рахунок взаємодій між сусідніми клітинами, які через цитоплазматичні містки чи щілинні контакти здатні взаємно впливати на подальшу диференціацію одна одної.

Загальні принципи генетичної детермінації розвитку подібні в різних організмів. Найдетальніше вивчено диференційну експресію генів у ході розвитку представників роду Drosophila та нематоди Caenorhabditis elegans. Нижче розглянуто генетичні аспекти ембріогенезу саме цих організмів.

Генетичний контроль розвитку Drosophila

Для комах роду Drosophila характерний життєвий цикл із повним перетворенням: утворення дорослої особини (імаго) із заплідненого яйця здійснюється через проходження декількох личинкових стадій, які розділені періодами линьки. Упродовж стадії яйця та трьох личинкових стадій визначаються осі майбутнього зародку, закладаються й розвиваються основні сегменти трьох частини тіла імаго - голови, грудей і черевця. Таким чином, ембріональний розвиток Drosophila можна умовно поділити на три етапи: 1 - визначення передньо-задньої та дорсовентральної осей зародку, 2 - детермінація кількості сегментів тіла та їхньої орієнтації (полярності) і 3 - специфікація сегментів, тобто набуття ними індивідуальних характеристик, притаманних лише даному сегменту. Усі етапи розвитку перебувають під жорстким контролем певного набору генів.

Особливістю розвитку Drosophila є утворення на перших етапах дроблення зиготи синцитію: при послідовних мітотичних поділах розділення цитоплазми проходить не повністю й новоутворені ядра мають спільну цитоплазму. Це сприяє вільному руху цитоплазматичних детермінант і є важливим у визначенні осей зародку. Пізніше відбувається міграція ядер до периферії, добудовуються клітинні мембрани та створюється шар приблизно із 6 тис. клітин на зовнішній поверхні ембріона.

Визначення осей зародку контролюється набором генів, які дістали назву гени полярності яйця. Продукти цих генів (мРНК і відповідні білки), створюють градієнти концентрацій від одного полюса яйця до іншого, забезпечуючи таким чином спрямовану детермінацію осей зародку - дорсовентральної та передньо-задньої. Нерівномірний розподіл цих цитоплазматичних детермінант (їх іще називають морфоге-нами) підтримується за допомогою різних механізмів. По-перше, певні молекули РНК мають сигнали локалізації - елементи послідовності нуклеотидів, які, утворюючи певну просторову структуру, зумовлюють спрямований транспорт РНК у необхідне місце цитоплазми яйцеклітини та утримання там. По-друге, активність трансляції таких РНК є різною в різних частинах яйцеклітини, що також спричинює відмінності в концентраціях морфогенів. Як уже відмічалося, наявність цитоплазматичних детермінант та розподіл їх у яйці залежить лише від активності генів яйцеклітини. Отже, перший етап розвитку Drosophila залежить лише від материнських генів.

Серед генів, які контролюють дорсовентральну полярність яйця, найважливішим є dorsal. Білковий продукт цього гена є транскрипційним фактором, що регулює активність декількох інших генів. Різниця в ядерних концентраціях білка Dorsal із максимумом у вентральній частині яйця і мінімумом у дорсальній (цитоплазматична концентрація при цьому змінюється в протилежному напрямку) приводить до специфічної активації генів, які зумовлять розвиток відповідних дорсальних і вентральних структур.

Серед генів, які контролюють передньо-задню полярність яйця виділяють два найголовніших - bicoid і nanos. мРНК bicoid синтезується під час дозрівання яйцеклітини та після запліднення транспортується до передньої частини зиготи. Транспорт мРНК bicoid у заданому напрямку забезпечується наявністю в її З'-нетрансльованій ділянці специфічного локалізаційного елемента послідовності, що розпізнається білковими факторами. Експресія мРНК bicoid у передній частині заплідненого яйця створює градієнт концентрації білка Bicoid, яка зменшується в передньо-задньому напрямку. Білок Bicoid, як і Dorsal, є транскрипційним фактором і забезпечує експресію генів, необхідних для розвитку головного та грудного відділів. мРНК nanos, аналогічно до мРНК bicoid, синтезується під час дозрівання яйцеклітини. У процесі розвитку зиготи створюється градієнт концентрації білка Nanos (РНК-зв'язувальний білок), протилежний до такого білка Bicoid: з максимумом у задній частині зародку та мінімумом у передній (рис. 6.17).

За участю також інших генів два описані градієнти мають визначальний вплив на детермінацію утворення основних структур черевця.

Детермінація кількості сегментів тіла та їхньої полярності. Після визначення основних осей зародку, активуються гени сегментації. Їхня активність спостерігається після запліднення яйцеклітини, тому вони не є генами з материнським ефектом. Відомо близько 30 генів сегментації, які становлять три групи:

gap-гени визначають утворення великих ембріональних структур, які майже збігаються з трьома частинами тіла дорослих особин. Мутації цих генів можуть привести до повної відсутності всіх грудних сегментів, декількох черевних тощо (рис. 6.18, а).

•    pair-rule-гени детермінують утворення структур, з яких розвиваються окремі сегменти тіла. Мутанти за цими генами можуть бути позбавлені або всіх парних, або непарних сегментів (рис. 6.18, б).

segment-polarity-гени відповідають за організацію та взаємну орієнтацію певних структур у межах одного сегменту. Мутанти за цими генами можуть бути позбавлені деяких сегментних структур або дзеркально дублювати однакові структури в межах певного сегмента (рис. 6.18, в).

Рис. 6.18. Приклади мутацій gap-генів (а, мутація Kruppel -елімінація грудних і перших п'яти черевних сегментів), pair-rule-генів (б, мутація even-skipped - елімінація непарних грудних і парних черевних сегментів) і segment-polarity-генів (в, мутація gooseberry -дзеркальне відтворення передніх частин сегментів у їхній задній частині) у дрозофіли. Г - грудні, Ч - черевні сегменти.

Експресію gap-генів контролюють білки Bicoid і Nanos. Найважливішим gap-геном є hunchback, необхідний для детермінації розвитку головного та грудного відділу. Активація його транскрипції перебуває під контролем білка Bicoid, а блокування трансляції - під контролем білка Nanos. Це означає, що в місці локалізації Bicoid утворюються структури, характерні для головного та грудного відділів, а в місці локалізації Nanos їхнє утворення блокується - розвивається черевний відділ. У свою чергу, gap-гени є регуляторами активності pair-rule-генів, які контролюють роботу segment-polarity-генів. Таким чином, у ході розвитку дрозофіли спостерігається чітка ієрархічна регуляція активності генів, на кожному щаблі якої визначаються все менші за розміром елементи тіла дорослої особини (рис. 6.19).

Визначення індивідуальних характеристик окремих сегментів.

Після того як гени сегментації визначили кількість сегментів та їхню полярність, активуються гени, що детермінують індивідуальні характеристики й подальші шляхи розвитку кожного сегмента - гомеозисні гени (рис. 6.19). Контроль експресії гомеозисних генів здійснюється білками генів сегментації. Продуктами гомеозисних генів є різноманітні регуляторні білки, здатні взаємодіяти з ДНК і регулювати роботу генів, які будуть визначати утворення відповідних морфологічних структур (антен, ніг, очей, крил тощо) із клітин кожного окремого сегмента. Мутації гомеозисних генів викликають порушення в розвитку окремих сегментів: наприклад, спостерігається утворення ніг замість антен із головного сегмента дрозофіли. Отже, активність гомеозисних генів, що залежить від оточення клітини й сегмента, в якому вона міститься, визначає остаточну диференціацію.

У Drosophila гомеозисні (або селекторні) гени утворюють два кластери (Antennapedia-комплекс і bithorax-комплекс) у третій хромосомі й разом формують гомеозисний комплекс (НОМ-С). Комплекс Antennapedia містить п'ять генів, які відповідають за диференціацію клітин головного та переднього грудного сегмента. Комплекс bithorax має три гени, які визначають остаточний розвиток задніх грудних та черевних сегментів. Кожен із гомеозисних генів містить консервативну послідовність із 180 пар основ (гомеобокс) - у білковому продукті гена гомеобоксу відповідає ДНК-зв'язувальний домен (гомеодомен), що складається із 60 амінокислотних залишків.

Hox-гени (від homeobox containing genes) знайдені в усіх досліджених видах рослин і тварин, що свідчить про універсальність систем регуляції диференціації клітин еукаріотичних організмів. У ссавців та інших хребетних Hox-гени також формують кластер із 9-11 генів, продукти яких - транскрипційні фактори - детермінують розвиток певних районів зародку вздовж передньо-задньої осі.

Розвиток Caenorhabditis elegans

Розвиток нематоди C. elegans від зиготи до дорослої особини включає чотири личинкові стадії, які розділяються періодами линяння (L1, L2, L3 та L4). Протягом кожної личинкової стадії формуються окремі структури й диференціюються тканини тіла дорослої особини. Після останнього линяння утворюється доросла особина, яка має 959 соматичних клітин у гермафродитних форм або 1031 у самців. Доля кожної окремої клітини в ході розвитку C. elegans є відомою, тобто кожна клітина має свій описаний "родовід", який починається від першого дробленням зиготи й завершується утворенням функціональної диференційованої клітини.

У результаті першого поділу зиготи в передньо-задній площині зародку утворюються дві неоднакові за розміром клітини - АВ (велика, нащадки якої будуть формувати клітинні лінії передньої частини зародка) і Р1 (мала, її нащадки формуватимуть клітинні лінії задньої частини зародка). При цьому лише клітина Р1 має у своїй цитоплазмі Р-гранули - специфічні цитоплазматичні детермінанти, необхідні для утворення попередників статевих клітин. Подальший поділ клітини Р1 у передньо-задній площині дає дві клітини EMS (нащадки цієї клітини -MS та E - будуть визначати вентральну вісь зародка) і Р2. За рахунок нерівномірної сегрегації Р-гранул у цитоплазмі клітини Р1, ці гранули потрапляють тільки до клітини Р2 (усі клітини, які будуть мати Р-гранули після наступних поділів, і, відповідно, будуть детермінувати розвиток статевих клітин, позначаються літерою Р). При наступному поділі з Р2 утворяться дві клітини - С і Р3, поділ останньої зумовить появу ще двох клітин D і Р4 (рис. 6.20).

Отже, у перших поділах зиготи визначаються дорсовентральна та передньо-задня осі зародку, а шість клітин (АВ, MS, E, С, D і Р4), що утворюються при цьому, є попередниками шести основних клітинних ліній личинки нематоди, які сформують основні тканини та органи дорослої особини. Слід відзначити, що первинна детермінація попередників статевих клітин відбувається вже в першому поділі зиготи.

Шляхи детермінації та диференціації клітин інваріантні в усіх особин даного виду. Вони регулюються продуктами певних генів, які умовно можна розділити на три групи, що контролюють: а) детермінацію клітин; б) час детермінації клітин та їхній поділ; в) селективну загибель певних клітин у ході розвитку. Крім того, у диференціації клітин C. elegans значну роль відіграють міжклітинні взаємодії.

Найдетальніше генетичний контроль розвитку C. еlegans досліджено на прикладі формування вульви - жіночої статевої системи в гермафродитів. Вульва формується із семи клітин, одна з яких стає якірною клітиною, інші - клітинами-попередниками статевих шляхів, матки тощо. Вибір того, яка з клітин стане якірною, визначається щонайменше п'ятьма генами. При цьому важливою є не тільки сама наявність п'яти ключових генів, а також час їхньої експресії. Так, у мутантів за одним із цих генів - lin-14 - формування вульви відбувається на одну личинкову стадію раніше, ніж у нормі, що спричинює аномальний розвиток. Мутації, які змінюють час диференціації окремих клітин чи органів, називають гетерохронічними.

Після розподілу клітин на якірну та клітини-попередники, останні починають детермінуватися, утворюючи клітини трьох типів - первинні (1°), вторинні (2°) і третинні (3°). Цей етап перебуває під контролем щонайменше 15 генів, а сам процес детермінації має каскадний характер: якірна клітина стимулює розвиток первинної клітини, яка, у свою чергу, - вторинної і т. д. Особливе значення має місце взаєморозташування клітин: наприклад, при загибелі клітини 2°, найближча до неї клітина 3° стає вторинною. Тип регуляції детермінації, на який впливають оточуючі клітини, називається позиційним (рис. 6.21). Пізніше первинні та вторинні клітини-попередники будуть диференціюватися в тканини вульви, а третинні - у гіподерміс, який оточує вульву.

У процесі розвитку C. elegans шляхом послідовних мітотичних поділів утворюється 1090 соматичних клітин, дорослі особини -гермафродити при цьому мають 959 клітин, тобто 131 клітина елімінується протягом личинкових стадій. Універсальний для всіх еукаріотів механізм клітинної загибелі, при якому відбуваються точно запрограмовані біохімічні й морфологічні зміни окремих клітин, називається апоптозом.

Апоптоз контролюється великою кількістю внутрішньоклітинних і міжклітинних сигналів. Визначальну роль у розвитку запрограмованої клітинної загибелі відіграють специфічні протеази - каспази (розрізають молекули поліпептидів біля залишків аспарагінової кислоти). У клітині каспази знаходяться в неактивній формі - прокаспази - і не функціонують. Активація однієї з цих протеаз викликає каскадну активацію інших, що, у свою чергу, зумовлює активацію нуклеаз, деградацію ДНК і білків, які підтримують клітинні мембрани та цитоскелет, і, відповідно, загибель клітини. Сигналом для активації прока-спаз у процесі розвитку може бути нестача поживних речовин, факторів росту, міжклітинні сигнали різної природи тощо.

У C. elegans є три ключові гени, які контролюють селективну загибель клітин: ced 3, ced 4 і ced 9. Продукти генів ced 3 і ced 4 є індукторами апоптозу, мутації за цими генами зумовлюють повну відсутність елімінації 131 клітини. Продукт гена ced 9, навпаки, є інгібітором апоптозу: інактивація цього гена приводить до елімінації клітин, яка в нормі не відбувається. Білок Ced-3 є прокаспазою, що міститься у клітині в неактивній формі. Каспаза Ced-3 активується продуктом гена Ced-4, котрий індукує саморозрізання прокаспази й перетворення її в активу форму. У клітинах, в яких апоптоз не повинен відбуватися, білок Ced-4 блокований білком Ced-9. Апоптичний сигнал приводить до дисоціації Ced-9 від Ced-4 і запуску каспазного каскаду.

Гени, які контролюють апоптоз, досить консервативні. У хребетних знайдені білки, гомологічні таким C. elegans. Зокрема, білок bcl-2, як і його гомолог Ced-9, блокує апоптоз у клітинах ссавців. Обидва білки мають трансмембранний домен і розміщені на зовнішній поверхні мітохондрій, ядра та мембранах ендоплазматичного ретикулуму, що дозволяє їм виступати сенсорами апоптичного сигналу. Білок Apaf-1 (гомолог Ced-4 у ссавців) активує перетворення прокаспази 9 в активну форму і таким чином запускає активаційний каскад протеаз. Білки Ced-4 та Apaf-1 є адапторами апоптичного сигналу, а білками-ефекторами виступають різноманітні каспази (рис. 6.22).

Контрольні запитання і завдання

1.    Опишіть характерні особливості будови та еволюції еукаріотичних геномів.

2.    Як класифікують мобільні елементи? За якими механізмами здійснюється їхнє переміщення?

3.    Назвіть генетичні наслідки переміщення мобільних елементів у межах геному?

4.    Опишіть процес У^Л-рекомбінації імуноглобулінових генів.

5.    Що таке епігенетичне спадкування та в чому полягають його основні механізми?

6.    Що таке ефект положення гена?

7.    Які факти підтверджують ендосимбіотичну теорію походження мі-тохондрій і пластид?

8.    Опішить різні типи будови мітохондріальних геномів.

9.    Чим зумовлені особливості позаядерного спадкування?

10.    Опішить загальну схему визначення статі. Як розрізняють механізми визначення статі за природою стать-детермінуючого сигналу?

11.    Як визначається стать за прогамним типом? Епігамним типом?

12.    Охарактеризуйте механізми, які зумовлюють детермінацію статі за сингамним типом? Які є різновиди визначення статі за хромосомним типом?

13.    Як називається стать, представники якої мають дві ідентичні статеві хромосоми? Дві різні?

14.    Опішить механізм визначення статі у дрозофіли. Які особини називаються інтерсексами? Гінандроморфами?

15.    Як відбувається детермінація статі у ссавців?

16.    Як стать впливає на успадкування ознак? Які ознаки називають зчепленими зі статтю, обмеженими статтю, залежними від статі?

17.    Опішить механізми компенсації дози генів статевих хромосом у дрозофіли та ссавців? Що таке тільце Барра?

18.    Що таке тотипотентність?

19.    У чому полягає роль цитоплазматичних детермінант на ранніх етапах розвитку зиготи?

20.    Як визначаються осі ембріона у дрозофіли?

21.    Які групи генів відіграють основну роль у детермінації кількості сегментів тіла дрозофіли та їхньої полярності?

22.    Що таке гомеозисні гени? Яку функцію відіграють продукти гомео-зисних генів у індивідуальному розвитку дрозофіли? Ссавців?

23.    Опішить схему утворення клітин-попередників шести основних клітинних ліній при розвитку C. elegans.

24.    Опішить генетичний контроль розвитку вульви в C. еlegans. Які мутації називають гетерохронічними?

25.    Як відбувається запрограмована загибель клітин?

Категорія: Генетика

Автор: admin от 18-07-2013, 16:59, посмотрело: 4979