Природа генетичного матеріалу
Як фізичний об'єкт ген - це ділянка полімерної молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). Єдиним винятком із цього загального для всіх живих організмів правила є особливий клас вірусів, де роль носія інформації виконує інша нуклеїнова кислота (хімічний аналог ДНК) - рибонуклеїнова кислота (РНК). Численні типи РНК беруть також участь у процесах реалізації генетичної інформації в усіх організмах.
Фізико-хімічні властивості молекули ДНК роблять її надійним носієм спадкової інформації та забезпечують простий механізм реплікації -точного відновлення молекули (а отже, і спадкової програми) у дочірніх клітинах при клітинному поділі. Численні взаємодії, в які вступає ДНК з іншими молекулами (насамперед білками), зумовлюють певну схему упаковки ДНК у клітинах, експресію генетичної інформації та регуляцію цього процесу, а також здійснення інших операцій, суттєвих для функціонування спадкового апарату.
Структура ДНК
Хімічна будова нуклеїнових кислот
Мономерна одиниця нуклеїнової кислоти - нуклеотид - складається з трьох елементів: азотиста основа, пентозний цукор (рибоза або дезоксирибоза), залишок фосфорної кислоти (рис. 1.1).
 |
|
Рис. 1.1. Хімічна будова нуклеотиду. Наведено стандартну нумерацію атомів пентозного кільця |
 |
|
Рис. 1.2. Азотисті основи. Червоним позначено атом N, з'єднаний у нуклеотиді з С1' атомом пентози. Наведено стандартну нумерацію атомів кілець пуринів і піримидинів |
і гуанін (G); піримідини (Y) - урацил (U), тимін (T), цитозин (C). Загальне позначення для всіх основ - N. У складі нуклеотиду один із атомів азоту кільця (виділено червоним на рис. 1.2) приєднується ковалентним зв'язком до карбону пентозного цукру (рис. 1.1). Цей атом пентози позначається як С1' (символ ' прийнято додавати, щоб відрізняти атоми пентозного кільця від атомів азотистої основи). Інші С'-атоми пентози нумеруються далі по порядку їхнього розташування (рис. 1.1). До З'-атома завжди приєднана ОН-група. Пентоза, у складі якої ОН-група знаходиться також при 2'-атомі, називається рибозою. Пентоза іншого типу, яка також входить до складу нуклеїнових кислот, - дезоксирибоза -відрізняється лише заміною цієї ОН-групи на атом гідрогену.
Сполука азотистої основи та пентози називається нуклеозидом (залежно від типу азотистої основи: аденозин, гуанозин, цитидин, тимідин, уридин) або рибо- чи дезоксирибонуклеозидом (залежно від типу пентози). Рибонуклеозиди входять до складу РНК, дезоксирибо-нуклеозиди - до ДНК. Інша хімічна різниця між ДНК і РНК стосується складу піримідинових азотистих основ: T у ДНК замість U в РНК.
Фосфорилювання ОН-групи при 5'-атомі пентози в нуклеозиді приводить до утворення нуклеотиду (рис. 1.1). Таким чином, нуклеотид є нуклеозидфосфатом або нуклеозидмонофосфатом (NMP). Так, нуклеотид, що зображений на рис 1.1, є аденозинмонофосфатом (АМР).
Будівним матеріалом для синтезу полімерних нуклеїнових кислот є нуклеозидтрифосфати, у складі яких ще два фосфатні залишки послідовно приєднані до 5'-фосфату, - у реакціях синтезу вони відщеплюються.
При синтезі дві хімічні групи - ОН-група при З'-атомі пентози одного нуклеотиду та фосфат при 5'-атомі іншого - використовуються для утворення фосфодіефірного зв'язку між нуклеотидами (рис. 1.3). Отже, полінуклеотидний ланцюг має напрямок: на одному його кінці залишається 5'-фосфат (5'-кінець), на іншому - З'-ОН-група (З'-кінець). Послідовності нуклеотидів прийнято записувати в напрямку 5' ^ З', у тому ж напрямку відбувається синтез усіх нуклеїнових кислот. Генетична інформація записана в молекулі ДНК саме у вигляді послідовності нуклеотидів.
Отже, остов полінуклеотидного ланцюга являє собою фосфатні залишки (кожен із яких має негативний заряд за фізіологічних умов) і пентози, що чергуються - цукрофосфатний остов. Від цього остова відходять азотисті основи як бокові залишки.
Подвійна спіраль
Два полінуклеотидні ланцюги (насамперед ДНК, але в окремих випадках - також РНК або гібридні РНК-ДНК) можуть об'єднуватися в єдину дволанцюгову структуру (дуплекс), схему якої представлено на рис. 1.4. Таке об'єднання відбувається за жорсткої умови: певні азотисті основи повинні стояти одна проти одної - А проти Т (чи U), G проти C. Цей принцип комплементарності, сформульований Уотсоном і Кріком (James D. Watson, Francis H. C. Crick), зумовлений утворенням специфічних водневих зв'язків між екзоциклічними групами названих основ: два зв'язки в парі А-Т, три в парі G-C (рис. 1.5). Принцип комплементарності є ключовим для розуміння функціонування нуклеїнових кислот.
 |
|
Рис. 1.4. Схема об'єднання двох динуклеотидів у дволанцюгову структуру |
 |
|
Рис. 1.5. Комплементарні пари основ у складі ДНК з водневими зв'язками між основами |
Два ланцюги у складі дуплекса спрямовані в різні боки (є антипа-ралельними), цукрофосфатні остови (які добре взаємодіють з водою) розташовані зовні, пари основ - усередині цієї структури. Унаслідок взаємодій між площинами сусідніх пар основ (стекінг-взаємодій) по-лінуклеотидні ланцюги закручуються один навкруг одного в подвійну спіраль (рис. 1.6). Між остовами на поверхні спіралі утворюються два жолобки різного розміру - великий і маленький, в які "дивляться" певні екзоциклічні групи азотистих основ, не задіяні до утворення комплементарних водневих зв'язків.
 |
|
Рис. 1.6. Два варіанти зображення подвійної спіралі ДНК. Показано структуру додекамеру ДНК у кристалах (код структури у Protein Data Bank 355D). Зображення створено за допомогою програми UCSF Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera) |
За фізіологічних умов подвійна спіраль є досить стабільною структурою, саме в цій формі ДНК існує в живих системах. Різноманітні молекули РНК, як правило, є одноланцюговими, але окремі взаємокомпле-ментарні ділянки РНК часто також формують двоспіральні структури в межах однієї молекули.
Подвійним спіралям нуклеїнових кислот притаманний досить значний структурний поліморфізм, що залежить від послідовності пар основ, типу пентозного цукру та зовнішніх умов. Структура, зображена на рис. 1.6, є так званою В-формою ДНК: права спіраль з ~10,5 парами основ на виток. Саме в цій формі ДНК існує за фізіологічних умов in vivo.
Інша - А-форма (також права спіраль, ~11 пар основ на виток, значний нахил площин пар основ відносно осі спіралі) - реалізується у ДНК лише in vitro за певних умов, далеких від фізіологічних. Проте саме в А-формі існують подвійні спіралі РНК за фізіологічних умов (причиною є заміна дезоксирибози на рибозу). Крім того, ДНК може переходити в А-форму або наближену до неї в комплексах із білками.
Ще одна форма подвійної спіралі - Z-форма - є лівою спіраллю і реалізується тільки для альтернувальних послідовностей poly(GC) (коли G і C чергуються в ланцюзі). Такі послідовності є в природних ДНК, але перехід у Z-форму відбувається in vitro за умов, які дуже далекі від фізіологічних. Біологічне значення Z-форми залишається не зовсім зрозумілим, хоча знайдено білки, що мають високу спорідненість саме до неї, тобто можуть індукувати B^-Z перехід in vivo.
Структура основної фізіологічної B-форми ДНК не є абсолютно регулярною. Конформаційні особливості подвійної спіралі (ступінь закручення, локальні вигини, розміри жолобків тощо) суттєво залежать від послідовності пар основ - можна сказати, що послідовність несе інформацію про структурні особливості ДНК (подібно до того, як амінокислотна послідовність визначає просторову структуру білка). Крім того, послідовність пар основ зумовлює варіації стабільності подвійної спіралі (визначає, наскільки легко можна розвести полінуклеотидні ланцюги) і конформаційну рухливість (здатність спіралі до деформацій - вигинів, зміни спіральної періодичності тощо). Залежні від послідовності особливості структури подвійної спіралі та потенціал щодо конформаційних змін - основа механізму специфічного впізнання послідовностей ДНК білками.
Білково-нуклеїнові взаємодії
ДНК у живих системах постійно взаємодіє з великою кількістю білків. На поверхні ДНК розташовані фосфатні залишки та екзоцикліч-ні групи азотистих основ у жолобках. Саме ці групи й залучаються до контактів з амінокислотними боковими залишками та пептидними групами на поверхні білка. Усі білки, які взаємодіють із ДНК, можна розділити на дві категорії: такі, що зв'язуються з ДНК будь-якої послідовності, і ті, що здійснюють специфічне впізнання певної послідовності пар основ. Білки, котрі здійснюють таке впізнання, як правило, взаємодіють і з будь-якою іншою послідовністю ДНК неспецифічно.
Кілька прикладів структури білково-нуклеїнових комплексів наведено на рис. 1.7. Димер гістонів Н3-Н4 (рис. 1.7, а) здійснює неспецифічні електростатичні (іонні) взаємодії з фосфатами ДНК, виконуючи роль в упаковці ДНК у клітинному ядрі, про що йтиметься нижче. Інші білки, зображені на рис. 1.7, виконують роль регуляторів генної активності, специфічно впізнаючи певні ділянки послідовності.
 |
|
Рис. 1.7. Приклади білково-нуклеїнових комплексів: димер гістонів Н3-Н4 (а); лейциновий зіпер (б); катаболічний активаторний білок (в); білок із цинковими пальцями (г). Зображення створено за допомогою програми PyMOL (http://www.pymol.org/), використано структури з Protein Data Bank із кодами 1AOI, 1NWQ, 1CGP, 1ZAA |
Головною умовою реалізації контактів між ДНК і білком є взаємна підгонка структури взаємодіючих елементів унаслідок відповідних конформаційних перетворень: шляхом певних структурних перебудов (іноді невеликих, іноді досить значних) подвійної спіралі хімічні групи ДНК "підводяться" під контакти з білковими хімічними групами. Тобто для ефективного впізнання необхідна певна конформація подвійної спіралі та/або певні зміни цієї конформації. І те, й інше визначається послідовністю пар основ.
Шлях передачі інформації в живих системах: "центральна догма" молекулярної генетики
Магістральний шлях передачі інформації в біологічних системах відображає схема, яка була, виходячи з принципів структурної організації подвійної спіралі ДНК, запропонована у свій час Френсісом Кріком під назвою центральна догма молекулярної біології (рис. 1.8).
 |
|
Рис. 1.8. Центральна догма молекулярної біології та генетики |
Інформаційним джерелом є ДНК, а кінцевою точкою передачі інформації - білки (біополімери, побудовані з 20 типів амінокислот). Велике розмаїття амінокислотних послідовностей створює можливості для реалізації різноманітних шляхів укладання ланцюгів у просторі -утворення специфічних просторових структур білків для виконання певних специфічних завдань. Головним типом цих завдань є каталіз численних біохімічних реакцій (у тому числі тих, що забезпечують передачу біологічної інформації). Крім того, білки є основним будівним матеріалом будь-якої біологічної системи й зумовлюють виконання всіх інших біологічних функцій: транспорт речовин, передачу регуляторних сигналів, спрямовані рухи, захист від чужорідних молекул тощо. Отже, саме білки, головним чином, зумовлюють усі фізіологічні особливості та зовнішні ознаки організму.
Спадкова інформація, яка записана в послідовності нуклеотидів на ділянці ДНК, є інформацією про послідовність амінокислот у складі білка. Отже, ген - це окрема змістовна ділянка ДНК, у послідовності якої закодована амінокислотна послідовність білка. Проте, крім білкових, існує також велика кількість генів, кінцевими продуктами яких є різноманітні молекули РНК. Але незалежно від типу гена, первинним продуктом його активності (проміжним для білкових генів) є молекула РНК. Під час транскрипції нуклеотидна послідовність
одного з ланцюгів ДНК за принципом комплементарності переписується в нуклеотидну послідовність РНК - ДНК використовується як матриця, на якій будується комплементарна РНК-репліка. Молекула РНК, що синтезується на білковому гені, використовується далі як матриця для білкового синтезу - трансляції (переписування нуклеотид-ної послідовності РНК в амінокислотну послідовність білка).
Суттєвим моментом функціонування біологічної системи є не тільки реалізація (експресія) генетичної інформації, а й 'її збереження та подвоєння з метою передачі наступному поколінню. Подвоєння інформації - це відтворення молекули ДНК у двох ідентичних дочірніх копіях - реплікація. Головним 'її механізмом знову ж таки є принцип комплементарності: кожен із ланцюгів ДНК використовується як матриця для синтезу комплементарної ДНК-репліки.
З кількома суттєвими уточненнями (у деяких вірусів спадкова інформація міститься в молекулі РНК; в усіх організмів у процесі функціонування клітин працюють також шляхи передачі інформації з РНК на РНК і на ДНК; не тільки білки, але й РНК певних типів мають значення для клітинних фізіологічних процесів) центральна догма є головним фундаментальним принципом роботи апарату спадковості.
ДНК як генетичний текст: організація геномів
Як джерело інформації ген - це ділянка ДНК, у послідовності нук-леотидів якої записано інформацію про певний функціональний продукт. За типом цього продукту всі гени (сукупність генів даного організму називають генотипом) можна поділити на дві групи: гени, кінцевим продуктом яких є певні функціональні молекули РНК (гени РНК), і гени, у послідовності яких відповідно до генетичного коду (див. розділ 2) записано інформацію про послідовність амінокислот у складі білків (білкові гени). Гени РНК кодують різноманітні молекули РНК, що не піддаються трансляції (див. розділ 2): рРНК - рибосомні РНК (компоненти рибосом); тРНК - транспортні РНК (ключовий елемент системи трансляції); маленькі ядерні РНК; маленькі ядерцеві РНК; мікро-РНК; молекули РНК, що є компонентами деяких ферментів; інші види РНК, із яких ще не для всіх з'ясовані їхні функції. На білковому гені синтезується РНК-матриця для наступного синтезу білка - матрична (або інформаційна) РНК - мРНК.
Кодуюча послідовність ДНК, з якої під час транскрипції знімається інформація про послідовність нуклеотидів у складі РНК-репліки, є найважливішою змістовною частиною гена. Але для того, щоб відбулась експресія генетичної інформації (через синтез РНК і далі - білка), не менш важливими є регуляторні послідовності ДНК, які (за рахунок спорідненості до специфічних білків) використовуються для вмикання / вимикання транскрипції як першої стадії експресії гена. Отже, визначення гена можна сформулювати й так: ген - це ділянка ДНК, яка є необхідною і достатньою для повноцінного синтезу функціональної молекули РНК. Ділянка ДНК, яка може вважатися геном, має містити кодуючу послідовність із записаною інформацією про продукт, а також певний набір регуляторних елементів послідовності, від яких залежить запуск / блокування процесу транскрипції, шлях зчитування інформації тощо.
У кожній клітині багатоклітинного організму міститься кілька (іноді до кількох десятків) молекул ДНК - їхній набір однаковий для всіх клітин. Ця ДНК містить не тільки гени: принаймні мають бути з'єднувальні міжгенні ділянки. Сукупність послідовностей ДНК у клітинах даного організму називається геномом. На сьогодні повністю встановлено послідовності понад 700 бактеріальних і близько 100 еука-ріотичних геномів. Головна відмінність між ними полягає в тому, що у прокаріотичних геномах кодуючі послідовності становлять близько 95 %, тоді як частка кодуючих послідовностей у геномах еукаріотів не перевищує 3 %. Розміри деяких геномів і оцінку кількості білкових генів у їхньому складі наведено в табл. 1.1.
|
Таблиця 1.1. Розміри геномів і кількість білкових генів деяких організмів |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
* Для еукаріотів розмір геному та кількість молекул відображають половину ДНК у клітинному ядрі. |
Вірусні геноми побудовані надзвичайно "економно": кодуючі ділянки генів займають практично всю, порівняно невелику, вірусну ДНК. У геномі прокаріотичної клітини кількість ДНК і генів значно зростає, але зберігається принцип економічності щодо використання більшості послідовностей для кодування генетичної інформації. Наприклад, геном Escherichia coli представлений однією циркулярною молекулою ДНК (так званою бактеріальною хромосомою) довжиною 4,6 млн пар основ. Близько 90 % цієї ДНК припадає на кодуючі послідовності ~4,1 тис. білкових генів і ~120 генів РНК, що не транслюються.
Еукаріотичні геноми містять значно більшу кількість ДНК порівняно з геномами прокаріотів (див. табл. 1.1), причому переважна частина цієї ДНК представлена некодуючими послідовностями. У тому числі, приблизно половина еукаріотичного геному - це послідовності, представлені багатьма копіями (послідовності, що повторюються). Еукаріотична ДНК знаходиться у клітинному ядрі у складі хромосом, кожна хромосома містить одну гігантську лінійну молекулу ДНК. Послідовності, що повторюються, зосереджені, зокрема, на кінцях хромосом (теломери) та в зонах прикріплення хромосом до веретена поділу при мітозі та мейозі (центромери).
Характерною ознакою генів еукаріотів (на відміну від прокаріотів) є мозаїчний принцип будови кодуючої частини (рис. 1.9): власне кодуюча частина представлена послідовністю окремих змістовних ділянок - екзонів, розділених беззмістовними інтронами. Часто ек-зони відповідають окремим структурним доменам мультидоменних білків: еволюційне збирання білка з кубиків-доменів може здійснюватись шляхом перетасування екзонів на рівні ДНК. Беззмістовними інтрони є в тому сенсі, що не несуть інформації про кінцевий продукт, але в межах інтронів часто розташовані важливі регуляторні ділянки. Крім того, інтрони деяких генів можуть містити інші гени зі своїми інтронами та екзонами. При транскрипції молекула РНК синтезується суцільно (первинний продукт транскрипції - первинний транскрипт - має у своєму складі екзони та інтрони). Отже, необхідним етапом експресії гена є процес сплайсингу (розділ 2) - вирізання інтронів і зшивання екзонів у кінцевий транскрипт, який уже може бути використаний як матриця для білкового синтезу. При цьому сплайсинг може бути спрямований по різних шляхах (рис. 1.9) -альтернативний сплайсинг, - що приводить до утворення різних кінцевих продуктів - різних білків.
 |
|
Рис. 1.9. Мозаїчна будова кодуючої частини гена та схема утворення різних мРНК (ламані лінії - інтрони, що вирізаються) унаслідок альтернативного сплайсингу |
Загальна кількість генів у геномах вищих еукаріотів варіює приблизно від 20 до 30 тис. (табл. 1.1). Як показано на рис. 1.10, кодуючі послідовності цих генів займають лише ~1,5 % геному. Решта припадає на міжгенну ДНК (де розташовані також регуляторні ділянки), ін-трони (~30 %) і більше ніж половину геному становлять послідовності, що повторюються.
 |
|
Рис. 1.10. Приблизний відносний вміст послідовностей різних типів в еукаріотичному геномі |
Основні типи повторів, присутні в геномі вищих еукаріотів:
• гени, представлені кількома (а іноді до 1 тис.) копіями. Часто гени, котрі повторюються, згруповані в кластери, тобто знаходяться поряд один з одним;
• псевдогени - послідовності, які гомологічні певним генам, але не експресуються. До їхньої появи приводять, наприклад, порушення частини генів, що повторюються: непошкоджені гени беруть на себе функцію пошкоджених, а останні так і залишаються в геномі;
• багатократні повтори коротких послідовностей (тандемні повтори), частина яких розподілена по всьому геному, але більшість зосереджена в теломерних і центромерних зонах хромосом;
• інтерсперсні (дисперговані) мобільні елементи, здатні до переміщення та розмноження в межах геному. Мобільні елементи займають значну частину еукаріотичного геному (від 30 до 50 %), але розподілені в геномі нерівномірно: є довгі ділянки, що на 90 % представлені мобільними елементами, і такі зони, де інтерсперсні елементи відсутні. У цілому спостерігається негативна кореляція між щільністю генів і мобільних елементів. Детальніше про типи еукаріотичних мобільних елементів йтиметься в розділі 6.
Крім клітинного ядра, ДНК є також у мітохондріях і хлоропластах, де являє собою автономний, невеликий порівняй]' з ядерним, цитоплазматичний елемент еукаріотичного геному (див. розділ 6).
Структурна організація ДНК у клітинах
Циркулярна ДНК бактеріальної хромосоми існує в клітині у вигляді комплексу з білками. Ця взаємодія є досить динамічною, і практично весь бактеріальний геном (що принципово відрізняє його від еукаріотичного) перебуває в потенційно транскрипційно-активному стані: гени є об'єктами швидкої оперативної регуляції у відповідь на зміну зовнішніх умов.
Загальна довжина ДНК у ядрі еукаріотичної клітини - близько 2 м. Така кількість ДНК вимагає її щільної упаковки, яка зумовлює тотальне пригнічення функціональних активностей у більшій частині геному. Але при цьому упаковка ДНК у клітинному ядрі має дозволяти вибіркову активацію певних ділянок у певні моменти часу. Ці альтернативні завдання вирішуються завдяки тому, що ДНК існує в клітинному ядрі у вигляді складного нуклеопротеїнового комплексу - хроматину. Нуклеопротеїновий комплекс, який містить одну гігантську лінійну молекулу ДНК називають хромосомою.
Структура хроматину
На першому рівні організації хроматину ДНК формує за рахунок взаємодії з білками елементарні утворення - нуклеосоми. Білковий компонент нуклеосоми (кор) складається з восьми молекул корових гістонів Н2А, Н2В, Н3 і Н4 - по дві молекули кожного типу (див. структуру димеру Н2А-Н2В, який є компонентом кора, на рис. 1.7, а). Окта-мерний комплекс гістонів має на своїй поверхні своєрідний трек позитивно заряджених амінокислотних залишків, який використовується для взаємодії з нуклеосомною ДНК довжиною 145 пар основ: ДНК утворює на поверхні октамера ~1,7 витка лівої суперспіралі (рис. 1.11).
 |
|
Рис. 1.11. Структура нуклеосоми у двох проекціях. Зображення створено за допомогою програми UCSF Chimera, код структури у Protein Data Bank 1KX5 |
У хроматині вся ДНК формує нуклеосоми із середньою щільністю одна нуклеосома на 200 пар основ, сусідні нуклеосоми з'єднані між-нуклеосомними лінкерними ділянками. Нуклеосомна ДНК разом із лінкерною ділянкою становлять так званий нуклеосомний повтор,
довжина якого варіює як уздовж полінуклеосомного ланцюга, так і залежно від функціонального стану, типу клітин тощо. Характер розподілу нуклеосом уздовж геномної ДНК має важливе функціональне значення: зрозуміло, що лінкерна ДНК є більш доступною для зовнішніх регуляторних впливів.
Як показано на рис. 1.11, кінцеві невпорядковані ділянки гістонів (хвости) виходять за межі нуклеосоми. Завдяки своїй структурній лабільності вони беруть участь в організації хроматину на наднуклеосом-ному рівні, а також відіграють важливу роль платформи для зв'язування різноманітних білків. Така взаємодія з білками має важливі функціональні наслідки для регуляції генної активності й залежить від посттрансляційних модифікацій хвостів - приєднання певних хімічних груп до певних амінокислотних залишків: ацетилювання, фос-форилювання, метилювання та деяких інших. Співвідношення між характером модифікацій і набором білків, які впізнають певний розподіл модифікованих груп по хвостах, називають гістоновим кодом.
Лінкерні ділянки, якими з'єднані сусідні нуклеосоми, продовжують хід нуклеосомної ДНК по прямій: у результаті нуклеосоми у складі полінуклеосомної нитки розташовані зиґзаґом (рис. 1.12). За рахунок взаємодії з ДНК невпорядкованих хвостів корових гістонів і молекул п'ятого гістона - гістона Н1 (одна молекула на нуклеосому) - полінук-леосомний зиґзаґ конденсується з утворенням так званої фібрили діаметром 30 нм - другого рівня компактизації хроматину.
 |
|
Рис. 1.12. Зиґзаґоподібна конфігурація полінуклеосомної нитки |
Фібрила діаметром 30 нм є основною формою хроматину під час інтерфази - періоду між клітинними поділами. Однак у хроматині існує значна гетерогенність за ступенем конденсації. З одного боку, передумовою активації окремих ділянок хроматину є деконденсація фібрили. З іншого, - у репресованих ділянках хроматинова фібрила може бути як додатково стабілізованою в компактному стані, так і піддаватися компактизації більш високого порядку. Частина хроматину, що зберігає стан підвищеної компактизації протягом ін-терфази, називається гетерохроматином (решта хроматину, де в принципі може відбуватися активація транскрипції, позначається як еухроматин). Утворення гетерохроматину здійснюється головним чином у ділянках, що містять повтори - у центромерах, теломерах та суміжних перицентромерних і субтеломерних ділянках, зонах концентрації мобільних елементів.
На наступному рівні структурної організації у клітинному ядрі хроматинова фібрила формує петлі, кінці яких жорстко закріплені на скелетних білкових структурах клітинного ядра - ядерному матриксі (рис. 1.13). Одна петля, що містить від 20 до 200 тис. пар основ ДНК (один або кілька генів) часто розглядається як важливий елемент регуляції процесів транскрипції та реплікації. Із білками матриксу взаємодіють ділянки ДНК довжиною від 300 до 1 тис. пар основ - ділянки, асоційовані з матриксом (MAR, Matrix Associated Regions).
Ядерний матрикс - це система білкових філаментів, яка формує структурний каркас ядра. На периферії ядра розташована особлива частина матриксу, асоційована із внутрішньою ядерною мембраною -ядерна ламіна. Від ламіни всередину ядра протягнуті філаменти внутрішнього ядерного матриксу. З ламіною взаємодіє значна частина гетерохроматину, зокрема центромери й теломери хромосом. Еухро-матинова частина хромосоми "звисає" всередину ядра, де хроматино-ві петлі закріплюються на внутрішній частині матриксу. У результаті хромосома займає певну зону в об'ємі ядра - хромосомну територію.
Хромосоми
У соматичних клітинах переважної більшості багатоклітинних організмів існує подвійний (парний) набір хромосом: гомологічні хромосоми кожної пари містять майже однакові молекули ДНК із майже однаковим набором генів, які розташовані вздовж молекули ДНК в однаковому для двох хромосом порядку (мають певні визначені місця у хромосомі - хромосомні локуси). Таким чином, можна розглядати ген як певний хром.осомний локус. При утворенні статевих клітин (гамет) до однієї з них переходить по одній хромосомі від пари гомологічних хромосом (див. процес мейозу, описаний нижче) - статева клітина містить одинарний (гаплоїдний) набір хромосом. Відповідно, при заплідненні відбувається об'єднання двох гаплоїдних хромосомних наборів з утворенням диплоїдного набору нащадка. Оскільки дві гомологічні хромосоми походять від різних особин, вони не є абсолютно ідентичними: певні гени можуть бути відсутніми в одній із гомологічних хромосом або мати відмінності у своїх нуклеотидних послідовностях. Різні варіанти одного гена (локусу) називають алелями даного гена.
Слід зауважити, що хромосомні набори багатьох організмів, які розмножуються статевим шляхом, містять одну пару статевих хромосом (усі інші хромосоми називають аутосом.ами), які представлені двома негомологічними типами. Як правило, одна зі статей є гомогаметною (містить дві статеві хромосоми одного типу), інша - гетерога-метною (різні статеві хромосоми), на чому й базується визначення статі нащадка при заплідненні (див. розділ 6). Слід зазначити також, що зазвичай під геном.ом виду розуміють сукупність послідовностей ДНК у гаплоїдному наборі. Саме в цьому розумінні наведено дані щодо розмірів геномів і кількості хромосом у табл. 1.1.
Коли клітина вступає в мітоз, після реплікації ДНК (і, відповідно, подвоєння диплоїдного набору хромосом) починається утворення над-компактної мітотичної хромосоми, деталі структурної організації якої залишаються недостатньо зрозумілими. Одночасно з компактизацією хроматинової фібрили частина ламіни "розчиняється" разом із ядерною мембраною, інша частина, разом із внутрішнім матриксом, перебудовується з утворенням білкового каркасу мітотичної хромосоми - хромосомного скефолду (scaffold), з яким залишаються зв'язаними основи хроматинових петель. Компактна мітотична хромосома, яка після відповідного забарвлення стає видимою під оптичним мікроскопом, має два плеча (рис. 1.14), розділених центромерною перетяжкою.
Центромера, що розділяє два плеча хромосоми, є ділянкою хромосоми, на якій відбувається утворення складного мультибілкового комплексу - кінетохору, необхідного для прикріплення мікротрубочок веретена поділу. На перших стадіях мітозу унаслідок реплікації ДНК (див. нижче) кожна хромосома представлена двома сестринськими хроматидами, з'єднаними між собою своїми центромерами за рахунок білок-білкових взаємодій. Пізніше веретено поділу забезпечує розходження дочірніх хромосом (див. обговорення мітозу нижче).
Довжина центромерної ділянки ДНК сильно варіює (від 125 пар основ у дріжджів Saccharomyces cerevisiae до 0,1-4 млн пар основ у людини). У деяких видів, скажімо, у нематоди Caenorhabditis elegans та в річкового рака, окремі хромосоми мають дифузну центромеру -мікротрубочки прикріплюються по всій довжині хромосоми (так звані голоцентричні хромосоми). Найчастіше послідовність ДНК в ділянці центромери представлена тандемними АТ-збагаченими повторами й не містить активних генів. Гомології між центромерними послідовностями різних організмів чи певних консенсусних мотивів, притаманних лише центромерній ДНК, немає: провідну роль у визначенні структури центромери відіграють білки, які взаємодіють із ДНК у цій ділянці. Центромерні білки (одним із головних є, зокрема, CENP A -аналог гістону Н3, який входить до складу нуклеосом у центромерній зоні) забезпечують компактизацію центромерної зони хромосоми та рекрутують до цієї зони білки кінетохору.
Розміщення центромери на певній хромосомі є постійною характеристикою: під час кожного клітинного поділу локалізація видимої під мікроскопом центромерної перетяжки не змінюється. Залежно від розміщення центромери хромосоми розподіляють на три типи (рис. 1.15):
• метацентричні хромосоми - центромера ділить хромосому на два плеча, приблизно однакових за довжиною;
• субметацентричні хромосоми - центромера ділить хромосому на два плеча, різних за своєю довжиною; плечі позначають латинськими літерами p (коротке плече) і q (довге плече);
• акроцентричні хромосоми - центромера ділить хромосому на два плеча, довжина яких різниться настільки сильно, що під мікроскопом короткі плечі майже не помітні.
 |
|
Рис. 1.15. Фото трьох типів мітотичних хромосом людини (пар сестринських хроматид, з'єднаних центромерами): метацентрична (а), субметацентрична (б), акроцентрична (в). Стрілкою позначено центромерну перетяжку |
Кожне плече хромосоми закінчується теломерою - комплексом те-ломерної ДНК на кінці хромосоми та специфічних теломерних білків. Довжина теломерної ділянки варіює в різних організмів (наприклад, у миші понад 30 тис. пар основ, у людини їх 10-15 тис.). Крім того, довжина теломери часто залежить від типу тканини, проліфератив-ної активності клітини тощо.
Розмір хромосом, їхня кількість, відносний розмір плечей - усе це є специфічною видовою характеристикою. Сукупність морфологічних ознак, за якими можна охарактеризувати набір мітотичних хромосом даного організму (виду) називають каріотипом.
Слід зупинитися на особливому випадку, коли окремі хромосоми можна побачити за допомогою оптичного мікроскопа не лише під час мітозу. У деяких клітинах (різноманітні тканини личинок комах, клітини трофобласту у ссавців, клітини зародкового міхура в рослин тощо) хромосоми мають гігантські розміри й видимі постійно. Це стає можливим за рахунок того, що хромосома складається не з однієї молекули ДНК, а з декількох сотень і навіть тисяч ідентичних молекул, які накопичуються в результаті багаторазової реплікації без проходження клітиною мітотичних поділів (ендоредуплікація). Такі хромосоми називають політенними. Загалом реплікація без наступного поділу клітини приводить до виникнення багатьох наборів молекул ДНК - поліплоїдизації (див. розділ 4). Але на відміну від полі-плоїдних клітин, при політенії однакові копії молекули ДНК контактують між собою по всій довжині, що й дозволяє побачити їх як одну гігантську деконденсовану хромосому.
Політенні хромосоми на цитологічних препаратах мають характерну поперечну посмугованість: темні смуги (диски, або хромомери) чергуються зі світлими (міждисками), створюючи специфічний лише для даної хромосоми малюнок. Вважається, що в області дисків переважно розміщенні гени, активація яких зумовлює характерне здуття диска - появу так званого пуфа. Великий розмір політенних хромосом, можливість досить легкої ідентифікації конкретних ге-номних ділянок, хромосомних перебудов тощо - усе це робить політенні хромосоми зручним об'єктом дослідження в цитогенетиці. Біологічна роль політенії, можливо, пов'язана з високою метаболічною активністю певних клітин.
Реплікація ДНК
Комплементарне спарювання нуклеотидів у складі подвійної спіралі ДНК негайно вказує на механізм копіювання генетичної інформації шляхом реплікації. Синтез ДНК відбувається при реплікації з використанням обох полінуклеотидних ланцюгів як матриць -за так званим напівконсервативним механізмом: дві дочірні моле-кули-копії містять один материнський ланцюг (що служив матрицею) і один ланцюг, синтезований de novo. Включення нуклеотидів до ланцюга, що синтезується, детермінується матрицею за принципом комплементарності. Базові молекулярні механізми реплікації є спільними для всіх організмів.
Зростання ланцюга ДНК відбувається в напрямку від 5'- до З'-кінця. Субстратами реакції є З'-кінцева ОН-група дезоксирибози зростаючого ланцюга та дезоксирибонуклеозидтрифосфати (рис. 1.16). Фермент, що каталізує цю реакцію, - ДНК-залежна ДНК-полімераза.
Реплікація ДНК починається з невеликої ділянки - ориджину (origin), де здійснюється ініціація процесу, головним моментом якої є розходження ланцюгів ДНК. Далі з ходом реплікації такий репліка-тивний міхур (рис. 1.17) розростається у двох протилежних напрямках. На кожному боці міхура існує так звана реплікативна вилка, в основі якої й відбувається синтез ДНК.
 |
|
Рис. 1.17. Реплікативний міхур - дві реплікативні вилки, які переміщуються у протилежних напрямках (ланцюги, що синтезуються, показано тільки для однієї з них) |
У кожній реплікативній вилці працюють дві молекули ДНК-полі-мерази, що здійснюють синтез двох полінуклеотидних ланцюгів. Оскільки два ланцюги є антипаралельними, а синтез здійснюється тільки в напрямку від 5'- до З'-кінця, то синтез тільки одного з ланцюгів може відбуватися (і відбувається) безперервно, починаючись від ориджину (рис. 1.17). Цей ланцюг називають лідируючим, його З'-кінець розташований поблизу від основи реплікативної вилки. Синтез іншого ланцюга розпочинається від реплікативної вилки: синтезуються окремі фрагменти - так звані фрагменти Оказакі, які пізніше з'єднуються між собою. Для синтезу кожного з фрагментів треба спочатку звільнити певний простір на матричному ланцюзі - пересунути реплікати-вну вилку вперед (рис. 1.17); відповідно, фрагментарний ланцюг називають ланцюгом., що запізнюється. Середня швидкість реплікації на одну реплікативну вилку становить ~750 нуклеотидів за секунду в бактерій, 60-90 нуклеотидів за секунду в еукаріотів. Синтез бактеріальної хромосоми відбувається за ~50 хв, повна реплікація ДНК еу-каріотичної клітини - за кілька годин.
Ділянку ДНК, де здійснюється реплікація, яка розпочинається з однієї точки, називають репліконом. Бактеріальна хромосома часто містить тільки один ориджин (зокрема, в E. coli) - являє собою єдиний реплікон. У деяких бактерій може бути два реплікони на хромосому. Еукаріотична хромосома є полірепліконом - містить велику кількість точок ініціації. Загалом геном, наприклад ссавців, містить близько 40 тис. ориджинів. Розмір еукаріотичного реплікона варіює від 50 до 200 тис. пар основ, що збігається з розмірами петельних доменів хроматину. Отже, хроматинова петля - це один реплікон, а ориджин збігається з ділянкою, асоційованою з ядерним матриксом. Сусідні реплікони еукаріотичної хромосоми врешті-решт "зустрічаються", унаслідок чого утворюються дві копії ДНК хромосоми.
Більшість ДНК-полімераз мають дві ферментативні активності: власне полімеразну, за рахунок якої до З'-кінця ланцюга, що синтезується, приєднуються нуклеотиди, і З’-екзонуклеазну, яка використовується для редагування помилок - відщеплення помилкових нуклеотидів, щойно приєднаних до З'-кінця. ДНК-полімераза є прецизійним молекулярним пристроєм: 'її полімеразний активний центр забезпечує впізнання комплементарного нуклеотиду в складі матриці нуклеозидтрифосфатом, приєднує цей черговий нуклеотид до зростаючого ланцюга (рис. 1.16) і пересувається на один нуклеотид уперед уздовж матриці, знову повторюючи вказані операції з наступ-ним нуклеотидом. При цьому частота помилкового включення нук-леотидів забезпечується на рівні ~10-5. Але оскільки ДНК синтезується "раз і назавжди" перед її передачею нащадкам, такий рівень помилок не може вважатися задовільним. Якщо внаслідок приєднання помилкового нуклеотиду утворилася некомплементарна (тобто нестабільна) пара основ, спрацьовує нуклеазний активний центр, помилковий нуклеотид відщеплюється, і ДНК-полімераза здійснює нову спробу подовження ланцюга. У результаті такої осциляції полі-мерази з перемиканням активності між двома центрами рівень помилок знижується до ~10-8. Остаточна частота помилок становить ~10-10 за рахунок активності систем репарації (див. нижче), які спрацьовують під час і відразу після реплікації.
Дві ДНК-полімерази, що працюють у реплікативній вилці, об'єднані в складний мультибілковий комплекс - реплісому, компонентами якої є також інші важливі структурні та функціональні модулі: ДНК-геліказа - АТР-залежна молекулярна машина, що руйнує подвійну спіраль попереду від реплікативної вилки; праймаза, яка забезпечує синтез праймера - короткої ділянки РНК на початку кожного фрагмента Оказакі, після чого праймер подовжується ДНК-полімеразою (сама ДНК-полімераза не здатна ініціювати синтез нуклеїнової кислоти, а може тільки продовжувати синтез праймера); компоненти, що сприяють утриманню ДНК-полімераз у реплікативній вилці тощо.
РНК-праймер на початку кожного фрагмента Оказакі має бути замінений на відповідну послідовність ДНК. Ця робота виконується за рахунок 5'-екзонуклеазної активності певних ферментів, після чого ДНК-полімераза заповнює прогалину між сусідніми фрагментами Оказакі. У результаті між двома фрагментами Оказакі залишається одноланцюговий розрив, який зшивається ще одним важливим ферментом - ДНК-лігазою.
У клітині Escherichia coli працюють ДНК-полімерази трьох типів (позначаються римськими цифрами). Дві з них (І та ІІІ) належать до класу полімераз високої точності синтезу, ДНК-полімераза ІІ - поліме-раза низької точності, яка використовується в певних репараційних процесах. Основна реплікативна полімераза - ДНК-полімераза ІІІ. ДНК-полімераза І (або полімераза Корнберга), на відміну від інших ДНК-полімераз, має також додаткову 5'-екзонуклеазну активність -саме ця полімераза й використовується при з'єднанні фрагментів
Оказакі під час реплікації (видаляє праймер і заповнює прогалину), а також при репараційних процесах синтезу ДНК.
П'ять типів еукаріотичних ДНК-полімераз високої точності прийнято позначати грецькими літерами. Основними ДНК-синтезуючими (під час реплікації та репарації) є ДНК-полімерази б і є. Вони ж заповнюють прогалину між фрагментами Оказакі, що утворюється після видалення праймера певною нуклеазою. Полімераза а використовується як праймаза при ініціації синтезу лідируючого ланцюга й кожного фрагмента Оказакі (синтезує РНК-праймер і трохи подовжує його як ДНК). Полімераза в використовується при ексцизійній репарації основ Полімераза у - реплікативна ДНК-полімераза мітохондрій.
В еукаріотичних клітинах працює ще досить велика кількість ДНК-полімераз низької точності (Z, П, 1> к), функція яких полягає в забезпеченні синтезу ДНК у випадку пошкодження матриці.
Характерною особливістю еукаріотичної системи реплікації є те, що подвоюється не циркулярна, як у прокаріотів, а лінійна молекула ДНК - така, що має два кінці. Унаслідок цієї простої обставини на З'-кінцях матричних ланцюгів ДНК залишаються одноланцюгові хвости (рис. 1.18): два РНК-праймери на 5'-кінцях ланцюгів, що синтезовані, видаляються, а прогалина не може бути заповненою, оскільки немає З'-кінця, який міг би бути використаним як праймер. Одноланцюгові хвости піддаються швидкій нуклеазній деградації, і після кожної реплікації ДНК повинна вкоротитися.
Кінцеві ділянки молекул ДНК, що містяться у клітинному ядрі, -теломери - складаються з невеликих елементів послідовності (шість, рідше вісім нуклеотидів), які тандемно повторюються - теломерних повторів. У хребетних і більшості вищих рослин теломерний повтор є однаковим - TTAGGG. Подовження теломер після реплікації здійснюється за допомогою спеціального ферменту - теломерази, яка є РНК-залежною ДНК-полімеразою. РНК-матриця входить до складу самого ферменту й містить ділянку, комплементарну теломерному повтору. Використовуючи 'її як матрицю і З'-кінець як праймер, те-ломераза покроково добудовує до З'-кінця кілька копій теломеразного повтору. Теломераза є активною у проліферуючих недиференційова-них клітинах і в злоякісно трансформованих клітинах і неактивною -у диференційованих соматичних клітинах вищих еукаріотів. Певне критичне скорочення теломер, яке відбувається у таких клітинах після кількох десятків клітинних поділів, є одним із ключових механізмів активації програми їхньої загибелі (див. розділ 6).
Подовжений теломеразою одноланцюговий хвіст використовується як матриця для синтезу іншого ланцюга за звичайним реплі-кативним механізмом. Після видалення РНК-праймера на кінцях подовженої хромосоми (у складі G-ланцюгів, збагачених на гуанін) залишаються одноланцюгові З'-вирости (як на рис. 1.18). За рахунок взаємодії зі специфічними білками одноланцюговий виріст "втягується" у дволанцюгову ДНК, порушуючи при цьому водневі зв'язки дуплекса: утворюється закрита форма теломери, що називається t-петлею (рис. 1.19).
Основна функція t-петлі полягає в захисті кінців лінійної молекули ДНК від деградації екзонуклеазами та в тому, щоб зробити кінець хромосоми непомітним для репараційних систем: відкрита форма те-ломери буде сприйматися репараційними системами як розрив, що може призвести до об'єднання кінців двох різних хромосом.
Репарація ДНК
Репарація ДНК - один із загальних біологічних процесів, спрямований на виправлення помилок синтезу ДНК при реплікації, а також численних пошкоджень, що виникають у ДНК унаслідок дії хімічних і фізичних факторів. До таких пошкоджень відносять різноманітні хімічні модифікації азотистих основ, ковалентні зшивки сусідніх пі-римідинів (утворення піримідинових, найчастіше тимінових, димерів) під дією ультрафіолетового випромінювання, одно- і дволанцюгові розриви, що виникають під дією іонізуючої радіації та вільних радикалів тощо. Часто системи репарації працюють під час або відразу після реплікації. Більшість репараційних процесів передбачає видалення пошкодженої одноланцюгової ділянки з наступним синтезом ДНК за допомогою ДНК-полімераз. Але є й такі процеси, що пов'язані з безпосереднім "виправленням" пошкодженого елемента за рахунок прямої дії певних ферментів (пряма репарація).
Жодна репараційна система не має 100-відсоткової ефективності -частина пошкоджень залишається в ДНК, унаслідок чого відбуваються заміни нуклеотидів, утрати ділянок послідовності та інші порушення спадкової програми - мутації (детальніше про мінливість генетичного матеріалу йдеться в розділі 4). Зрозуміло, що порушення репараційних систем приводять до підвищення частоти мутацій -прискорення мутаційного процесу.
Найочевиднішим випадком прямої репарації є зшивання однолан-цюгового розриву ДНК лігазою.
Іншим спільним для більшості живих організмів (за винятком, наприклад, ссавців) шляхом прямої репарації є так звана фоторе-активація - руйнування піримідинових димерів (рис. 1.20), індукованих ультрафіолетовим світлом, ферментом фотоліазою. Фотоліаза (або 'її власні амінокислотні залишки, або зв'язані з білком просте-тичні групи) здатна поглинати світло, що зумовлює активацію ферменту. Тобто світло, викликаючи утворення піримидинових димерів, одночасно активує фотоліазу, яка каталізує розрив ковалентних зв'язків між сусідніми піримідинами (рис. 1.20) і, таким чином, відновлення структури ДНК.
Одним із загальних пошкоджуючих впливів на ДНК є алкілування азотистих основ - ковалентне приєднання метильних чи етильних груп до атомів О або N. Пряма репарація таких пошкоджень є можливою за рахунок активності специфічних метилтрансфераз, що відщеплюють метильні групи.
Більш радикальним і ефективним шляхом виправлення порушень нуклеотидів є ексцизійна репарація, коли пошкоджена одноланцюго-ва ділянка вирізається з ДНК, а інший ланцюг використовується далі як матриця для нового синтезу. Існує два варіанти такої репарації. При ексицизійній репарації азотистих основ (Base Excision Repair
- BER), що відбувається в усіх організмів, модифікована азотиста основа розпізнається ферментом, який відщеплює її від дезоксирибози (рис. 1.21). У ДНК залишається так званий АП-сайт - апурино-вий / апіримідиновий. Ще два ферменти видаляють дезоксирибозу в АП-сайті, і в ДНК залишається прогалина довжиною в один нуклеотид.
Ця прогалина заповнюється ДНК-полімеразою в (в еукаріотів), яка приєднує нуклеотид до 3'-ОН групи попереднього нуклеотиду ланцюга. Фосфодіефірний зв'язок приєднаного нуклеотиду з наступним нуклеотидом ланцюга відновлюється лігазою. У прокаріотів заповнення прогалини здійснюється ДНК-полімеразою І.
Ексцизійна репарація нуклеотидів (Nucleotide Excision Repair - NER)
- це шлях, пов'язаний із вирізанням одноланцюгової ділянки ДНК, яка містить пошкодження (модифіковану основу, тиміновий димер тощо).
 |
|
Рис. 1.21. Ексцизійна репарація азотистих основ. Пошкоджена основа забарвлена червоним |
У клітинах E. coli за цей шлях відповідає а система uvrABC (uvr -ultra violet repair). Комплекс білка uvrB і двох білків uvrA упізнає пошкодження та зв'язується з ДНК у цьому місці (рис. 1.22). На наступному кроці відбувається зміна конформації uvrB, вигин ДНК і дисоціація uvrA. До комплексу рекрутується білок uvr^ Обидва білки у складі комплексу набувають ендонуклеазної активності: uv^ робить одноланцюговий розріз у пошкодженому ланцюзі за кілька нуклеоти-дів у напрямку до 5'-кінця від пошкодження (ліворуч на рис. 1.22); uvrB - розріз з іншого боку від пошкодження. Далі ДНК-геліказа uvrD руйнує подвійну спіраль між двома розрізами, тобто видаляє пошкоджену ділянку. Прогалина, що залишилася, заповнюється ДНК-полі-меразою І, лігаза остаточно відновлює цілісність ланцюга.
Аналогічна система ексцизійної репарації, до якої залучено близько 17 білків, працює в еукаріотичних клітинах.
Репарація некомплементарних пар основ - місметчів
Незважаючи на редагування помилок під час реплікації, певна кількість невірно спарених основ залишається в синтезованих ланцюгах ДНК. Зрозуміло, що при репарації таких місметчів (mismatch) із двох некомплементарних нуклеотидів замінити слід саме той, що входить до синтезованого, а не до матричного ланцюга.
У бактеріальній клітині за репарацію місметчів відповідає система mutHLSU. По бактеріальному геному розподілені (на середній відстані 256 пар основ) короткі послідовності CTAG (які є паліндромами - читаються однаково в обох ланцюгах від 5'- до 3'-кінця), де аденін піддається постреплікативному метилюванню. Але певний час після реплікації метильованим є лише матричний (материнський) ланцюг. Саме за цей час і спрацьовує система репарації (рис. 1.23): білок, що позначається як mutS, упізнає місметч і рекрутує білок mutL, останній взаємодіє з двома білками muffl, які зв'язуються з тетрануклеотидними паліндро-мними сайтами по обидва боки від місметча. У складі утвореного комплексу muffl набуває ендонуклеазної активності й робить одноланцюго-вий розріз у неметильованому ланцюзі в межах одного із сайтів (один із двох сайтів обирається випадково). Далі геліказа mutU (той самий білок, що й uvrD) розплітає подвійну спіраль, а екзонуклеаза руйнує ланцюг від розрізу до місметча і трохи далі. Нарешті прогалина заповнюється ДНК-полімеразою ІІІ і одноланцюговий розрив зшивається лігазою.
Система mutHLSU є консервативною, гомологічні білки присутні також і в еукаріотів. Метилювання аденіну не використовується для дискримінації ланцюгів: білки еукаріотичної системи репарації місмет-чів пов'язані з реплісомою та ланцюгами ДНК, що синтезуються, тобто спрацьовують безпосередньо під час реплікації.
Іноді в клітині активуються процеси, які прийнято також називати репарацією, хоча насправді вони є засобом здійснити реплікатив-ний синтез ДНК, "не звертаючи уваги" на пошкодження 'її структури. Реплікативна машинерія зазвичай зупиняється, зустрічаючи пошкодження у складі матриці. Якщо таких пошкоджень надто багато, й істинні репараційні системи не встигають їх виправити, перемикання на неточний синтез ДНК дає клітині шанс на виживання. Пошкодження при цьому залишаються, що спричинює виникнення мутацій. Усі процеси такого типу зазвичай об'єднують під назвою SOS-репарації, або (що точніше) - механізмів синтезу ДНК, толерантних до пошкоджень (damage tolerance mechanisms).
У прокаріотів перемикання на неакуратний синтез, який дозволяє долати перешкоди, відбувається завдяки заміні ДНК-полімерази ІІІ на полімеразу низької точності синтезу - ДНК-полімеразу V (полімераза активується у відповідь на несприятливі умови, скажімо, на ультрафіолетове опромінювання). Ця полімераза вставляє напроти тимінового димеру два довільні нуклеотиди (виникає мутація), після чого замінюється на ДНК-полімеразу ІІІ, яка продовжує точний синтез. Крім того, долати невеликі одноланцюгові прогалини при SOS-репарації допомагає ДНК-полімераза ІІ - інша полімераза низької точності. Аналогічним чином перемикання на полімерази низької точності відбувається й в еукаріотів у разі наявності в матриці пошкоджених основ, піримідинових димерів тощо.
Інший шлях здійснення реплікації, оминаючи пошкодження у складі матриці, отримав назву постреплікативної (рекомбінаційної) репарації. За наявності пошкодження (наприклад, тимінового димеру) реплісома може його "обійти", залишивши прогалину в ланцюзі, що синтезується (рис. 1.24). У цьому випадку на її місце шляхом гомологічної рекомбінації (про неї йтиметься у відповідному підрозділі) вставляється ділянка сестринської молекули ДНК. Прогалина, що залишається при цьому в сестринській молекулі, легко заповнюється ДНК-полімеразою. Як і при SOS-репарації, пошкодження залишається і може бути виправлено пізніше завдяки ексцизійній репарації.
Репарація дволанцюгових розривів
Точна репарація дволанцюгового розриву ДНК можлива лише під час або відразу після реплікації, коли розірвана ділянка може бути відновлена завдяки використання сестринської молекули як матриці за механізмом гомологічної рекомбінації (див. нижче).
В інших випадках цілісність розірваних молекул ДНК відновлюється в консервативному для всіх організмів процесі, який називається негомологічним з’єднанням кінців (NHEJ - Non-Homologous End Joining, рис. 1.25). З'єднуються при цьому будь-які кінці ДНК, що, за наявності великої кількості розривів, приводить до об'єднання ділянок різних хромосом - хромосомних перебудов (розділ 4).
Ключову роль у процесі NHEJ відіграють білки Ku, які розпізнають кінці ДНК, об'єднують їх у нековалентний комплекс і рекрутують до нього низку інших білків. У складі комплексу відбувається розплітання кінцевих ділянок ДНК і пошук мікрогомології - коротких комплементарних (чи майже комплементарних) одноланцюгових ділянок, котрі належать різним молекулам. У результаті утворюється короткий дуплекс, зайві одноланцюгові ділянки відщеплюються нуклеазами, лігаза зшиває одноланцюгові розриви. Таким чином, у процесі з'єднання відбувається втрата кількох пар основ.
Гомологічна рекомбінація ДНК
Суттєвим моментом існування ДНК у живих системах є не тільки процеси відновлення та збереження інформації, яка міститься в послідовності нуклеотидів, а й різноманітні дії, спрямовані на перетасування цієї інформації з метою створення нових комбінацій генів. Найважливішою серед подібних операцій є гомологічна рекомбінація -обмін ділянками між досить довгими молекулами ДНК із гомологічними послідовностями пар основ. Такий процес відбувається в усіх організмів, котрі розмножуються статевим шляхом, між гомологічними хромосомами при мейозі (у процесі утворення статевих клітин). Також гомологічна рекомбінація можлива в парах гомологічних дочірніх молекул ДНК при реплікації в соматичних клітинах (мітотична рекомбінація) і в прокаріотів, скажімо, після кон'югації двох бактеріальних клітин і проникнення ДНК із однієї в іншу (див. розділ 5).
Необхідною умовою для здійснення гомологічної рекомбінації є гомологія послідовностей між двома молекулами ДНК по всій довжині. Загальну модель початкового етапу гомологічної рекомбінації зображено на рис. 1.26. Ініціюючою подією є дволанцюговий розріз в одній із гомологічних молекул (здійснюється спеціальними ферментами). Цей розріз за рахунок активності комплексу білків recBCD (тут і далі вказано назви білків, які забезпечують гомологічну рекомбінацію в E. coli, гомологічні білки є також і в еукаріотів) "розширюється" шляхом 5'-екзонуклеазної деградації ДНК - у результаті в місці розрізу залишаються два одноланцюгові З'-хвости. Один із них (у комплексі з білком recA) здійснює інвазію - утворює подвійну спіраль з антипаралельним ланцюгом інтактної гомологічної молекули ДНК. Інший ланцюг цієї останньої виштовхується з дуплексу у вигляді одноланцюгової D-петлі (від displacement). Разом із З'-хвостом D-петля здатна переміщуватись у пошуку гомології - максимальної комплемен-тарності в межах подвійної спіралі, яка утворилася між ланцюгами двох гомологічних молекул ДНК. На наступному кроці відбувається репараційний синтез ДНК: два З'-кінці розірваної молекули ДНК подовжуються ДНК-полімеразами з використанням як матриць двох ланцюгів інтактної молекули. До цього моменту схема на рис. 1.26 є одночасно схемою точної репарації дволанцюгового розриву в одній із двох сестринських молекул ДНК під час реплікації.
Під час рекомбінації відновлення цілісності ДНК є тільки завершенням початкового етапу. У результаті інвазії та репараційного синтезу дві молекули ДНК об'єднуються, утворюючи два перехрещення ланцюгів - дві структури Холідея (Robin Holliday). Кожна така структура може переміщуватись (так звана міграція гілки), результатом чого є подовження гетеродуплекса - подвійної спіралі між двома майже комплементарними ланцюгами двох гомологічних молекул ДНК.
Розглянемо окрему одну структуру Холідея. Як видно з рис. 1.27, 'її можна піддати ізомеризації, повернувши два дволанцюгові кінці на 180°. Саме у формі без перехрещення ланцюгів (праворуч на рисунку) структура Холідея фіксується завдяки її взаємодії з білком ruvA: білок зв'язується з центром хреста, утримуючи чотири однолан-цюгові ділянки у приблизно планарній квадратній конфігурації. З ruvA та двома дуплексами, що виходять із хреста в протилежних напрямках, взаємодіють два гексамерні білкові комплекси ruvB, які в АТР-залежному процесі забезпечують протягування ланцюгів через комплекс гиуА / гиуВ - міграцію гілки з одночасним подовженням гетеродуплекса.
Останньою подією рекомбінації є розділення (resolution) структури Холідея резольвазою - білком гиуС. Резольваза - це ендонукле-аза, дві молекули якої взаємодіють із комплексом гиуА / гиуВ і двома ланцюгами хреста, розташованими один проти одного (є два рівноймовірні варіанти такого зв'язування). Отже, резольваза робить дволанцюговий розріз через хрест двома можливими шляхами (рис. 1.28). Після наступного зшивання розривів лігазою залишаються дві дволанцюгові молекули ДНК.
На рис. 1.28 зображено ізомеризовану чотириланцюгову структуру з рис. 1.26 - дві структури Холідея з перехрещеннями перетворені на планарні (ділянки, які синтезовані шляхом репарації, не позначено) - і результат її розділення. Із чотирьох можливих комбінацій розділення двох структур Холідея показано дві. Одна з них приводить до рекомбінації (аналогічно, рекомбінантною є і пара розрізів 2 + 4): дві гомологічні молекули ДНК обмінялися ділянками, і умовна "абетка", якою позначено фрагменти ДНК, змінює регістр -великі літери замінюються на маленькі та навпаки. У масштабі цілих хромосом результатом рекомбінації є дві молекули, показані в центральній частині рис. 1.29. Пари розрізів 1 + 4 і 2 + 3 не приводять до рекомбінації. Отже, рекомбінація при розділенні структур Холідея відбувається з імовірністю 50 %.
 |
|
Рис. 1.28. Схема розділення двох структур Холідея. Конфігурація чотирьох ланцюгів зверху є еквівалентною конфігурації на нижній панелі рис. 1.26. Літерами позначено ділянки ланцюгів (великі й маленькі літери відповідають гомологічним ділянкам двох молекул, літери зі штрихом і без - комплементарним ділянкам вихідних дуплексів). Цифрами 1-4 позначено можливі розрізи резольвазою. Унизу: дві пари дволанцюгових молекул після розділення структур Холідея, отримані в результаті відповідних розрізів |
Незалежно від того, чи відбулася рекомбінація, усі продукти містять гетеродуплекси (середня частина всіх кінцевих молекул на рис. 1.28). Оскільки гетеродуплекси складаються з майже комплементарних ланцюгів, вони містять місметчі. Відповідно, кінцевою операцією, яка завершує процес гомологічної рекомбінації, є репарація цих місметчів описаною вище системою mutHLSU. На відміну від того, як ця система спрацьовує після реплікації, після рекомбінації ланцюг, де відбувається заміна нуклеотидів, обирається випадково, наприклад, центральний фрагмент першої молекули на рис. 1.28 перетворюється або на В/В', або на b/b'. Якщо на цій ділянці розта-
шований ген, шляхом репарації обирається один із його алелів -В чи b. Отже, ефектом рекомбінації може бути явище конверсії гена -заміни одного алеля на інший.
Іншим наслідком рекомбінації є обмін ділянками між двома гомологічними хромосомами - кросинговер (рис. 1.29). Під час процесу рекомбінації кросинговер між двома хромосомами може відбутися (і часто відбувається) у кількох точках (рис. 1.29). Зрозуміло, що чим більшою є відстань між двома хромосомними локусами, із тим вищою ймовірністю відбудеться обмін ділянками десь між цими локусами, і тим більшою буде кількість таких обмінів. Два локуси, що рознесені по хромосомі на велику відстань, починають поводити себе як незалежні (не зв'язані в одній хромосомі) спадкові елементи. У цьому, власне, і полягає біологічне значення гомологічної рекомбінації (детальніше ефекти кросинговеру описано в розділі З.)
Серед інших процесів рекомбінації ДНК розрізняють сайт-специфічну рекомбінацію (вирізання / вбудовування однієї молекули ДНК з / в іншу за рахунок розпізнання специфічними білками коротких елементів послідовності ДНК, див. розділ 5), незаконну рекомбінацію (об'єднання двох молекул ДНК, які не мають ані гомології, ані специфічних елементів послідовності - основним механізмом є розглянуте вище негомологічне з'єднання кінців) і переміщення в межах геному мобільних елементів послідовності ДНК (розділ 6).
Клітинний цикл і клітинний поділ в еукаріотів
Реплікація ДНК відбувається під час так званої S-фази клітинного циклу, яка, у свою чергу, є одним з етапів інтерфази - періоду, коли хромосоми існують у вигляді хроматинових фібрил, і в клітині відбувається експресія генетичної інформації (рис. 1.30). Після закінчення реплікації та репараційних процесів, які її супроводжують, сестринські хроматиди (майбутні дочірні хромосоми), що утворюються внаслідок подвоєння ДНК, за рахунок взаємодії зі специфічними білками залишаються з'єднаними між собою. Клітина при цьому вступає у фазу G2, яку можна розглядати як підготовку до мітозу - клітинного поділу соматичних клітин.
На першій стадії мітозу - у профазі - відбувається конденсація хроматид, а також дозрівання двох центросом (структур, що складаються з двох центріолей кожна), формування веретена поділу та приєднання ниток веретена до хромосом (рис. 1.31). Наприкінці профази центросоми розходяться до полюсів клітини.
Далі в метафазі хромосоми (пари сестринських хроматид, з'єднаних між собою своїми центромерами) вишукуються по екватору клітини. Анафаза починається з роз'єднання центромер, після чого сестринські хроматиди, які тепер уже називаються дочірніми хромосомами, рухаються до полюсів. Під час телофази починається формування ядерних мембран і деконденсація хромосом. Закінчується телофа-за (і сам мітоз) цитокінезом - розділенням двох дочірніх клітин.
По закінченні мітозу клітина, що буде ділитися далі, вступає у фазу G1 клітинного циклу ('її можна розглядати як пререплікативну), а остаточно диференційована клітина, для якої цей мітоз став останнім, - у фазу G0 (рис. 1.30). Результатом мітозу є дві ідентичні клітини з двома ідентичними диплоїдними наборами хромосом.
При утворенні статевих клітин (гамет) шляхом мейозу в диплоїд-ній клітині-попереднику також відбувається реплікація ДНК і подвоєння хроматид, які залишаються зв'язаними своїми центромерами.
Мейоз здійснюється шляхом двох клітинних поділів (рис. 1.32). У профазі І (у ній розрізняють стадії лептотени, зиготени, пахітени, диплотени й діакінезу - на рисунку вони детально не показані) відбувається утворення так званих бівалентів, або тетрад, - комплексів гомологічних пар хроматид. Дві з чотирьох хроматид бівалента,
що належать гомологічним хромосомам, у кількох точках утворюють за участю певних білків синаптонемні комплекси, де починається процес гомологічної рекомбінації (рис. 1.32). У результаті частина гомологічних хромосом обмінюється своїми ділянками. Далі здійснюється поступова конденсація хроматид, і під мікроскопом можна побачити характерні перехрещення між хроматидами - хіазми, що утворилися внаслідок рекомбінації. Профаза І закінчується розділенням конденсованих бівалентів. Далі в метафазі І пари хроматид вишукуються по екватору, в анафазі І відбувається їхнє розходження, у телофазі І - остаточне розділення двох клітин, що містять подвійний набір молекул ДНК. Сестринські хроматиди при цьому залишаються з'єднаними в зоні своїх центромер.
Далі в другому поділі (профаза ІІ, метафаза ІІ, анафаза ІІ, телофаза ІІ на рис. 1.32 не показані) відбувається розділення центромер, розходження хромосом і поділ обох клітин - у результаті утворюються чотири гаплоїдні гамети. При заплідненні батьківські набори хромосом об'єднуються з утворенням диплоїдної зиготи, яка шляхом мітотичного поділу дає початок усім іншим клітинам багатоклітинного організму-нащадка.
Базові закономірності спадкування
Наведений вище огляд молекулярних і цитологічних основ організації спадкового апарату дозволяє сформулювати кілька загальних правил спадкування генів:
• гени є ділянками ДНК, які несуть інформацію про структуру білків і таких молекул РНК, котрі безпосередньо виконують певні функції;
• сукупність білків (головним чином) визначає всі фізіологічні й зовнішні ознаки організму, тобто вияв певної ознаки залежить від певної сукупності генів;
• гени містяться у хромосомах - білково-нуклеїнових комплексах, у кожний із яких входить одна довга молекула ДНК;
• при розмноженні одноклітинних організмів нестатевим шляхом і поділі соматичних клітин багатоклітинного організму дочірні клітини отримують повний набір генів від материнської клітини в незмінному вигляді.
Решта правил стосується багатоклітинних еукаріотів, які розмножуються статевим шляхом:
• у кожній клітині багатоклітинного організму існує набір пар гомологічних хромосом (диплоїдний набір); у даній ділянці (локусі) кожної з хромосом певної пари можуть міститися ідентичні гени або різні варіанти одного гена (алелі).
• при утворенні гамет кожна з них отримує тільки одну хромосому з кожної пари, але перед цим гомологічні хромосоми обмінюються своїми ділянками;
• нащадок одержує по одному набору хромосом (і, відповідно, по одному набору алелів) від кожного з батьків.
Хоча більшість ознак залежить від активності певної сукупності генів, є випадки (їх меншість, але все одно досить багато), коли прояву зовнішньої ознаки можна поставити у відповідність лише один ген. Розглянемо на простому прикладі, як реалізуються сформульовані вище правила.
Забарвлення насіння гороху залежить від гена sgr, що кодує білок SGR (гени прийнято позначати, як правило, маленькими літерами, виділяючи їх курсивом, їхні продукти - великими; наведене позначення походить від "stay green”). Білок бере участь у процесі руйнування хлорофілу, унаслідок чого зріле насіння набуває жовтого кольору (стають видимими жовті пігменти каротиноїди). Мутація в гені sgr приводить до того, що насіння зберігає зелений колір. Отже, маємо два алеля одного гена, які можна позначити як sgr+ (нормальний ген) і sgr- (мутантний ген), або ж як А та а відповідно. Якщо мутантний алель буде присутнім лише в одній хромосомі, алель А все одно виконає свою роботу, і насіння буде жовтим. У цьому разі прийнято казати, що алель А є домінантним., а алель а - рецесивним. Зелений колір насіння проявиться лише у випадку, коли обидві хромосоми будуть нести алель а - генотип буде гомозиготним за рецесивним алелем; гомозигота за домінантним алелем (АА) і гетерозигота (Аа) матимуть насіння жовтого кольору. Отже, якщо схрестити гомозиготи АА (жовті) та аа (зелені), усі нащадки першого покоління будуть гетерозиготами Аа з жовтим насінням.
Такі гетерозиготи будуть утворювати гамети двох типів: з алелем А або а в рівному співвідношенні. Якщо схрестити ці гетерозиготи першого покоління, то у другому поколінні на одну гомозиготу АА буде утворюватися в середньому одна гомозигота аа та дві гетерозиготи Аа (А - від батька, а - від матері або навпаки): особини з жовтим і зеленим насінням будуть отримані в кількісному співвідношенні 3 : 1.
Виходячи зі сформульованих вище положень, нами щойно отримано результат, опублікований Грегором Менделем (Gregor (Johann) Mendel) у 1866 р. Оскільки небагато знайдеться прикладів публікацій, з яких починалася б ціла наука, варто навести повне посилання на неї: Mendel G. Versuche uber Pflanzen-Hybriden // Verh. Na^rl'orsc^ Ver. Brunn. - 1866. - Bd. 4. - S. 3-47. Звичайно, Мендель нічого не знав про ДНК та 'її реплікацію, хромосоми, мейоз і таке інше; він просто досліджував кількість особин із певними ознаками у схрещеннях гороху з жовтим і зеленим насінням. Проте сформулював найпринциповіші положення генетики: ознаки залежать від дискретних спадкових факторів (Мендель не користувався терміном "ген"), кожен такий фактор існує в кількох формах, дві копії фактора містяться в соматичних клітинах, у гамети переходить тільки одна з них.
Навіть виходячи з матеріалу цього розділу, зрозуміло, що в більшості випадків закономірності спадкування будуть значно складнішими (наступні розділи присвячено подальшому з'ясуванню цих закономірностей). Наприклад, якщо розглядати два гени, які визначають пару деяких ознак (Мендель вивчав і цей випадок, досліджуючи колір і форму насіння), то вони будуть спадкуватися незалежно один від одного, якщо знаходяться в різних хромосомах (як це й було в його дослідах). Якщо ж два гени присутні в одній хромосомі (зчеплені), то вони спадкуються разом. Але тільки за умови, що вони не розійшлися по різних гомологічних хромосомах (та не потрапили до різних гамет) унаслідок кросинговеру. Детальніше менделівські закони спадкування та відхилення від них розглянуто в розділі 3.
Контрольні запитання і завдання
1. З яких трьох елементів складається нуклеотид? Чим хімічно відрізняються між собою рибо- і дезоксирибонуклеїнові кислоти?
2. Опишіть основні риси структури подвійної спіралі ДНК. Які взаємодії стабілізують подвійну спіраль? Що лежить в основі комплементар-ності нуклеотидів?
3. Опишіть магістральний шлях передачі спадкової інформації в живих системах.
4. Дайте визначення геному. У чому полягає найсуттєвіша відмінність між геномами про- та еукаріотів?
5. Що таке інтрон і екзон?
6. Назвіть основні типи послідовностей ДНК, що повторюються.
7. Із яких елементів складається нуклеосома? Як організована хрома-тинова фібрила у просторі?
8. Що таке ядерний матрикс і яка його роль в організації хроматину в клітинному ядрі?
9. Дайте визначення хромосоми, еухроматину, гетерохроматину.
10. Яка різниця між гаплоїдним і диплоїдним наборами хромосом? В яких клітинах багатоклітинних організмів вони присутні?
11. Опишіть морфологію мітотичної хромосоми. На які типи поділяють мітотичні хромосоми?
12. Що таке політенні хромосоми?
13. Дайте визначення реплікативної вилки. Яка різниця між двома ланцюгами ДНК, що синтезуються під час реплікації? Що таке фрагменти Оказакі?
14. Які ферментативні активності мають бактеріальні ДНК-полімерази? Порівняйте особливості та функціональне значення ДНК-полімераз І і ІІІ.
15. Що таке праймер та яка його хімічна природа?
16. Яку функціональну роль виконує теломераза?
17. Порівняйте ексцизійну репарацію основ і нуклеотидів.
18. Як здійснюється репарація місметчів у ДНК?
19. Як здійснюється репарація дволанцюгових розривів ДНК?
20. З якої події починається гомологічна рекомбінація? Що таке гетеродуплекс? Що таке структура Холідея?
21. З якою імовірністю відбувається обмін ділянками між двома гомологічними молекулами ДНК і від чого залежить реалізація такого обміну?
22. Що відбувається з гетеродуплексом після завершення гомологічної рекомбінації? Що таке конверсія гена?
23. Назвіть етапи клітинного циклу в багатоклітинних еукаріотів?
24. Опишіть процес мітозу.
25. Опишіть процес мейозу.
26. Сформулюйте базові закономірності спадкування генів.
Автор: admin от 18-07-2013, 14:21, Переглядів: 13396